通管方對輸卵管炎性阻塞性不孕大鼠模型VCAM－1，BAX表達的影響

郭 銳 匡繼林 劉英奇 王立蘭

（1.湖南中醫(yī)藥大學2009級研究生 湖南 長沙 410007；

2.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院 湖南 長沙 410005）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：選健康清潔級8－12周健康未孕雌性 Wistar雌性大鼠大鼠180只，體重190－210g；成熟雄性大鼠15只，體重200－220g。以上動物由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.1.2 藥物及試劑：通管方由湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院中藥房提供。血府逐瘀片，由濰紡中獅制藥有限公司生產(chǎn)，批準文號：國藥準字Z20100527；生產(chǎn)批號：20100527。原位雜交儀（ThermoBrite），購自上海深瑞儀器有限公司產(chǎn)品。濕盒 ：北京海生實驗器材有限公司。PNP筆：北京世橋生物有限公司。

1.1.3 菌種：大腸桿菌，菌號 ATCC25922；金黃色葡萄球菌，菌號ATCC25923，由湖南省中醫(yī)藥大學微生物教研室提供、培養(yǎng)。溶血性鏈球菌，菌號ATCC25921，購自湖南省疾病控制中心。細菌懸液0.1ml（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌，按2∶1∶1用無菌水稀釋，濃度為30×108／ml混合菌）。

1.1.4 主要實驗儀器：普通光學顯微鏡（CK－Z），醫(yī)用微波爐，BMJ－1型生物組織包埋機等。

1.2 方法

1.2.1 造模方法：造模方法借鑒馬寶璋教授的“混合菌接種法”［2］。具體操作如下。把150只造模組大鼠禁食不禁水12h，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，待麻醉起效后將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺上，手術(shù)部位剪毛，碘酒、酒精消毒皮膚，下腹正中作一約0.8－1cm長縱切口，打開腹腔，暴露一側(cè)部分子宮、輸卵管及卵巢，在子宮靠近輸卵管處向輸卵管方向注入混合細菌液0.1ml。造模過程中盡量避免損傷其他組織器官，縫合腹壁肌層、皮膚，再以75%的酒精消毒切口，同法處理對側(cè)。術(shù)畢將大鼠仰臥位放入鼠籠內(nèi)，待其自然蘇醒，然后觀察術(shù)后大鼠的情況，逐只大鼠進行造模；于造模術(shù)后第5、10、15、20天分別隨機從每組中抽樣對輸卵管進行肉眼觀察及病理組織形態(tài)學觀察。

1.2.2 給藥方法：雌性大鼠造模后共死亡25只，取材4只，存活121只。再按隨機排列表法分為模型組24只、血府逐瘀片組25只、通管方高劑量組24只、通管方中劑量組24只、通管方低劑量組24只。通管方低、中、高劑量組的給藥劑量為每毫升含生藥1.85g，3.70g，7.40g。陽性對照藥血府逐瘀片：使每毫升溶液含血府逐瘀片0.03g。于造模術(shù)后第20天開始經(jīng)口灌胃給藥，每日一次，其中通管方低、中、高劑量組分別灌服低、中、高三種劑量的通管方水煎劑，血府逐瘀組灌服血府逐瘀片混懸液，模型組灌服等量蒸餾水，灌胃體積為1.5ml／100g，正常組常規(guī)喂養(yǎng)。所有大鼠同一天開始灌胃，在灌胃15天、30天從各組中隨機抽樣8只進行取材，剩下的大鼠停止灌胃，用于觀察治療后受孕情況。

1.2.3 觀測指標

（1）組織形態(tài)的觀測：肉眼觀察觀察輸卵管外觀形態(tài)、色澤變化、與周圍組織粘連情況、是否有增粗或變細、以及有無積水或化膿等。觀察后，迅速切取輸卵管，放入4%多聚甲醛中固定，常規(guī)切片，HE染色，光鏡下觀察。

（2）VCAM－1，BAX檢測：原位雜交法檢測上皮細胞中VCAM－1，BAX的含量，用平均光密度值表明。

（3）大鼠受孕情況：灌胃結(jié)束后，觀察各組大鼠的受孕情況。

2 結(jié)果

2.1 組織形態(tài)學變化

15天觀察結(jié)果為：HE染色觀察結(jié)果為：正常組、模型組改變基本同前；血府逐瘀組：管壁結(jié)構(gòu)分界欠清晰，纖毛凌亂，部分脫落且融合粘連，大量纖維結(jié)締組織增生及炎性細胞浸潤；通管方低劑量組：管壁增厚結(jié)構(gòu)欠清晰，管腔狹窄，纖毛僅部分可見且粘連相互融合，大量纖維結(jié)締組織增生及炎性細胞浸潤；通管方中劑量組：管壁增厚，管腔縮小，纖毛部分脫落，粘連增粗，多量纖維結(jié)締組織增生及炎性細胞浸潤；通管方高劑量組：管腔基本通暢，管壁略粗結(jié)構(gòu)欠清晰，纖毛增生，血管充血，少量纖維結(jié)締組織增生及炎性細胞浸潤。

30天后HE染色結(jié)果為：

HE染色結(jié)果為：正常組、模型組改變基本同前；血府逐瘀組：管壁增厚，管腔尚通暢，纖毛較少可見粘連增粗，纖維結(jié)締組織明顯增生及炎性細胞浸潤；通管方低劑量組：管腔縮小，纖毛數(shù)量少，凌亂增粗，纖維結(jié)締組織增生及多量炎性細胞浸潤；通管方中劑量組：管壁略厚，管腔通暢，纖毛部分粘連，少量纖維結(jié)締組織增生及炎性細胞浸潤；通管方高劑量組：30天管腔通暢，管壁組織結(jié)構(gòu)較清晰，纖毛較多，分支少無粘連，灶性結(jié)締組織增生，無炎性細胞浸潤。

2.2 治療后上皮細胞中VCAM－1檢測結(jié)果：VCAM－1在正常組大鼠輸卵管上皮細胞中未見表達，模型組陽性表達比較明顯，與正常組比較差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。平均光密度值的統(tǒng)計學資料表明：藥物干預15，30天后，統(tǒng)計分析表明各組間VCAM－1含量差別均具有統(tǒng)計學意義（P＝0.000）。15，30天的對比具有統(tǒng)計學意義。不同分組的平均光密度是不同的。正常組與模型組，血府逐瘀組，通低組，通中組差別具有統(tǒng)計學意（P＝0.000），與通高組差別不具有統(tǒng)計學意義（P＝0.278）。模型組與各組差別具有統(tǒng)計學意義（P＝0.000）。血府逐瘀組與通低組差別不具有統(tǒng)計學意義（P＝0.05）。詳見表1。

2.3 治療上皮細胞中BAX檢測結(jié)果：BAX在正常組大鼠輸卵管上皮細胞中有一定量的表達，模型組的陽性表達明顯高于正常組，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。平均光密度值的統(tǒng)計學資料表明：經(jīng)藥物干預15天后，正常組與模型組，血府逐瘀組，通低組，通中組組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＝0.01），與通高組組間差異不具有統(tǒng)計學意義（P＝0.055）。血府逐瘀組與通低，中，高組組間差異具有統(tǒng)計學意義。通低組與通中，高組組間差異具有統(tǒng)計學意義。通中組與通高組組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＝0.01）。經(jīng)藥物干預30天之后，各組間差異均具有統(tǒng)計學意義（P＝0.000）。

表1 各組大鼠輸卵管上皮細胞VCAM－1蛋白表達強度的比較 （±s）

表1 各組大鼠輸卵管上皮細胞VCAM－1蛋白表達強度的比較 （±s）

注：15天多組比較F＝110.735；30天多組比較F＝197.731；與正常組比較△P＝0.000＜0.01；與模型組比較☆P＝0.000＜0.01，★P＝0.000＜0.01，★★P＝0.000＜0.01；與血府逐瘀組比較◆P＝0.000＜0.05，◇P＝0.000＜0.01；與通管方高劑量組比較＃P＝0.000＜0.01，＃＃P＝0.000＜0.01，＃＃＃P＝0.000＜0.01。

組別 n 15天 30天正常組8 0.000 0.000模型組 8 0.293±0.053△ 0.354±0.032△血府逐瘀組 8 0.185±0.027☆ 0.185±0.026★通管方低劑量組 8 0.131±0.022＃＃＃ 0.160±0.034★★＃通管方中劑量組 8 0.083±0.020★＃ 0.089±0.024◆＃＃通管方高劑量組 8 0.021±0.026★◇ 0.015±0.020★◇

15，30天的對比表明具有統(tǒng)計學意義。不同分組的多重比較具有統(tǒng)計學意義，正常組與模型組，血府逐瘀組，通低組，通中組差別具有統(tǒng)計學意義（P＝0.000），與通高組差別不具有統(tǒng)計學意義（P＝0.134）。模型組與各組差別具有統(tǒng)計學意義（P＝0.000）。血府逐瘀組與各組差別具有統(tǒng)計學意義（P＝0.000）。通管方各劑量組間差別具有統(tǒng)計學意義（P＝0.000）。詳見表2。

表2 各組大鼠輸卵管上皮細胞BAX表達強度的比較±s）

表2 各組大鼠輸卵管上皮細胞BAX表達強度的比較±s）

注：15天多組比較F＝121.050；30天多組比較F＝233.008；與正常組比較△P＝0.000＜0.01；與模型組比較☆P＝0.001＜0.01，☆☆P＝0.001＜0.01，★P＝0.000＜0.01，★★P＝0.000＜0.01；與血府逐瘀組比較◇◇P＝0.000＜0.01；

組別 n 1 5天 3 0天正常組 8 0.0 0 1±0.0 1 5＊0.0 0 2±0.0 1 8模型組 8 0.3 2 7±0.0 5 6△ 0.3 6 1±0.0 3 6△血府逐瘀組 8 0.1 8 9±0.0 2 8☆ 0.1 9 3±0.0 3 7☆☆通管方低劑量組 8 0.1 2 9±0.0 2 1＊＊ 0.1 2 3±0.1 2 1★通管方中劑量組 8 0.0 7 6±0.0 2 3★＃ 0.0 6 9±0.0 2 6通管方高劑量組 8 0.0 1 5±0.0 2 3★★◇ 0.0 1 0±0.0 1 9★★

2.4 對各組大鼠受孕情況的影響。結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組、對照組、通低組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。與正常組比較，通高組、通中組差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，通高組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，通高組、通中組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.05）；與通高組比較，通中組、通低組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；通中組與通低組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），與對照組比較，通高組、通中組、通低組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），詳見表3。

表3 各組大鼠受孕情況

5 討論

現(xiàn)代中醫(yī)認為，輸卵管炎性阻塞性不孕的病機為氣滯血瘀。目前對血瘀證的研究已經(jīng)進入細胞學和分子生物學水平［3］，概括起來主要為：血瘀證在血液流變學、血小板功能、內(nèi)皮細胞功能、微循環(huán)研究、血流動力學、免疫功能變化等方面的研究［4］。VCAM－1屬于黏附分子家族中的一員［5］，它在靜息的白細胞、內(nèi)皮細胞上呈低水平表達。體內(nèi)在炎癥的病理條件下VCAM－1表達在血管內(nèi)皮上［6］。

實驗結(jié)果表明：造模后模型組l0天、20天觀察VCAM－1含量明顯增多，高于正常組，說明VCAM－1參與了輸卵管的慢性炎癥反應。經(jīng)中藥水煎劑治療后，尤其是通高組，VCAM－1的含量明顯下降，說明降低VCAM－1含量可能是中藥湯劑治療炎性阻塞性不孕癥的機制之一。

BAX是BCL－2家族的前凋亡蛋白，是細胞損傷和刺激的傳感器［7］。1997年Koshida等利用免疫組織化學和臨床病理學方法研究胃癌細胞的凋亡，指出Bax高表達時，則凋亡指數(shù)高，Bax低表達或不表達時凋亡指數(shù)低［8］。

實驗結(jié)果表明：模型組中BAX的含量在5，10，15，20天觀察中發(fā)現(xiàn)呈上升趨勢，明顯高于正常組，并在第20天達到該實驗中的最高值，說明BAX高表達，細胞凋亡指數(shù)高。經(jīng)灌胃治療后，觀察15，30天輸卵管中BAX發(fā)現(xiàn)其呈下降趨勢，通高組下降弧度最大，說明細胞凋亡指降低，說明降低BAX的表達可能是中藥湯劑治療炎性阻塞性不孕癥的機制之一。

6 通管方治療輸卵管炎性阻塞性不孕癥的組方原則

中醫(yī)認為輸卵管炎性阻塞性不孕其病位在胞宮，胞脈，病機為氣滯血瘀，根據(jù)實邪為病治以攻邪為主，邪去則正安的原則，應采用活血化瘀，通絡止痛的治療大法。通管方是謝劍南教授根據(jù)多年治療輸卵管阻塞性不孕癥的臨床經(jīng)驗，運用中醫(yī)藥理論組方而成，驗之于臨床，效果顯著。通管方的組成：黨參15g、炒白術(shù)15g、當歸10g、赤芍10g、丹參10g、澤蘭10g、香附10g、乳香10g、沒藥10g、王不留行10g、路路通10g、三七6g、穿山甲7g、穿破石20g、薤白10g、茺蔚子10g和甘草5g。全方重在活血化瘀、通經(jīng)活絡。為了使藥物能充分的吸收，特將穿山甲，田三七研粉沖水吞服。另外服用該方，部分患者會出現(xiàn)大便稍稀，由此認為通管方可能使腸蠕動增加，有利于輸卵管粘連的松解。

本課題根據(jù)臨床常見病例，選擇了感染途徑與人類炎癥機制接近的動物模型。從致病病因來看，混合性病原體致炎符合臨床情況。從受體來看大鼠對致病菌也較為敏感。本研究從生理病理及生化角度研究了VCAM－1及BAX在輸卵管模型中的表達情況，從而揭示了通管方的作用機制，為為本藥的臨床應用提供理論依據(jù)。

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