新型斑蝥素羧酸衍生物的合成及其抗癌活性*

李賀敏，彭國平，陳 農，李賀萊

(1.南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210046;2.中國人民解放軍61769部隊，山西文水 041000)

斑蝥素對肝癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌及食道癌等具有良好的療效，其優勢在于在抑制腫瘤細胞的同時，不降低周圍血液中的白細胞數量，對機體沒有明顯的免疫抑制作用。這種少有的療效受到人們的廣泛關注［1，2］。

斑蝥素具有強烈的毒性，對其結構進行修飾改造可以降低其毒性。為此，研究人員們相繼合成了一系列去甲斑蝥素衍生物。研究表明，他們具有療效顯著、毒性低的特點。但當劑量增大時，仍有一定的臟器毒性，影響了抗癌效果［3～8］。因此，開發更新的高效低毒衍生物和研制增效減毒新劑型具有重要意義。

本文以DMSO為溶劑，5-氟脲嘧啶(5-Fu)為修飾物，對去甲斑蝥素(2)酸酐環部分進行結構修飾，合成了一個新型的去甲斑蝥素羧酸衍生物(3，Scheme 1)，收率 78.5%，其結構經1H NMR和IR表征。采用L9(33)正交試驗考察了原料比，反應溫度，反應時間及溶劑用量對反應的影響。結果表明，在最佳反應條件［2 0.5 mmol，n(2)∶n(5-Fu)=1.2，于 140 ℃ 反應 6 h，DMSO用量15 mL］下制備的3收率為78.2%。采用MTT法研究了體外3對人肝癌細胞HepG2的抑制活性。結果表明，3在用藥量為250 μmol·L-1時對HepG2的抑制率為89.5%，其IC50為232.4 μmol·L-1，強于 2 的抑制活性。

Scheme 1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

AC-500型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內標);Nicolet 360型傅立葉變換紅外光譜儀(KBr壓片，于105 ℃干燥［9］)。

順丁烯二酸酐，化學純，國藥集團化學試劑有限公司;呋喃和5-Fu，化學純，阿拉丁化學試劑公司;其余所用試劑均為化學純，其中丙酮經氯化鈣干燥24 h后使用。

1.2 合成

(1)7-氧雜雙環［2.2.1］庚-5-烯-2，3-二甲酸酐(1)的合成

在圓底燒瓶中依次加入THF 100 mL和順丁烯二酸酐7.5 g(0.77 mol)，攪拌下于室溫加入呋喃11 mL(0.15 mol)，攪拌使其溶解后反應24 h。抽濾，濾餅用無水乙醚洗滌，用乙酸乙酯重結晶得白色固體1 10.76 g，收率 92%，m.p.112.0 ℃ ～113.2 ℃;1H NMR δ:6.59(t，2H，5，6-H)，5.47(t，2H，1，4-H)，3.31(d，J=0.9 Hz，2H，2，3-H);IR ν:1 813，1 758(C=O)，1 655(C=C)，1 247(C-O-C)cm-1。

(2)7-氧雜雙環［2.2.1］-2，3-二甲酸酐(去甲斑蝥素，2)的合成

在反應瓶中加入1 10 g(60 mmol)和丙酮90 mL，攪拌使其溶解;加入5%Pd/C 1.5 g，抽真空，通氫氣氫化反應48 h。抽濾，濾液減壓蒸除溶劑得白色固體 2 9.3 g，收率 92.3%，m.p.113.3℃ ～115.2 ℃;1H NMR δ:3.39(m，2H，1，4-H)，3.00(m，2H，2，3-H)，1.62(m，4H，5，6-H);IR ν:1 801，1 746(C=O)，1 179(C -O -C)cm-1。

(3)3的合成

在反應瓶中依次加入2 84.1 mg(0.5 mmol)，5-Fu 78.1 mg(0.6 mmol)及 DMSO 15 mL，攪拌下于140℃(浴溫)反應6 h。蒸除過量DMSO，殘余物依次用甲醇、乙酸乙酯和正己烷重結晶得白色粉末 3 121.7 mg，收率 78.5%，m.p.193.5 ℃ ～195.2 ℃;1H NMR δ:11.5(s，1H，CO2H)，8.3(s，1H，NH)，7.8(s，1H，NCH)，4.8(m，2H，1，4-H)，3.7(m，2H，2，3-H)，1.8(m，4H，5，6-H);IR ν:3 500 ～ 3 100(NH)，1 713(C=O)cm-1。

1.3 體外抗癌活性測定

以5-Fu為對照藥劑，采用噻唑蘭(MTT)［10］比色法測定3對人肝癌細胞HepG2的抑制率。取對數生長期細胞以0.25%胰蛋白酶消化后，用培養液稀釋吹打成單細胞懸液。將細胞懸液(c2×105mol·mL-1)接種于 96孔板中，每孔 90 μL，培養24 h細胞貼壁后，試驗組分別加入10 μL的供試藥，空白對照組加入等體積的無血清培養液，陽性對照組分別加入c為20 μg·mL-1或30 μg·mL-1的5-Fu的 DMSO溶液，每組設5個復孔。加入試藥培養24 h和48 h，每個反應孔再加入新鮮配制20 μL的含5 mg·mL-1MTT的 PBS溶液，于37℃培養箱中繼續培養4 h。除去上清液，加入100 μL DMSO溶劑，振蕩，待結晶充分溶解混勻后，用酶標儀于490 nm處測定各孔的OD值，將每組的OD值代入下式，計算抑制率［11］。

2 結果與討論

2.1 合成3的反應條件優化

由于至今未見2與5-Fu反應的相關文獻，本文參考文獻［1］方法合成3。采用L9(34)正交試驗考察諸因素對反應的影響，尋找最佳反應條件，獲得最佳的合成3的方法。

2與5-Fu發生酰化反應時，2中不含有碳碳雙鍵，不會自聚，所以反應中不用加阻聚劑［12］。2和5-Fu的反應是酸酐的氨解反應，是一個動態反應體系，產物的收率受原料比［n(2)∶n(5-Fu)］(A)，反應溫度(B)，反應時間(C)及溶劑DMSO用量(D)的影響(表1)。

表1 合成3的正交試驗設計與結果*Table 1 Design and results of orthogonal experiment for synthesizing 3

由表1可見，A對收率影響最大。5-Fu過量有利于提高3的收率;當A=1.2時，收率最高。從表1還可見，各因素對收率的影響順序為:A＞B＞C＞D，最佳條件為A2B2C3D1。由于溶劑用量對收率影響不大，單獨考察DMSO用量對反應的影響，實驗結果表明，DMSO用量為15 mL時收率最高。最佳反應條件實為A2B2C3D3，即n(2)∶n(5-Fu)=1.2，于140℃反應6 h，DMSO 用量15 mL。用最佳反應條件(A2B2C3D3)做三次平行實驗，收率分別為78.2%，77.9%，78.5%，平均為78.2%，重現性較好。

2.2 抗癌活性

1～3的抗癌活性見表2。由表2可見，細胞在加入供試化合物24 h后，1～3對體外肝癌細胞的生長均有較強的抑制作用。1在用藥量為250 μmol·L-1時抑制率最高［(73.5 ±0.91)%，IC50268.2 μmol·L-1］，2 在用藥量為 500 μmol·L-1時抑制率最高［(67.6 ±2.7)%，IC50281.9 μmol·L-1］，3 在用藥量為 500 μmol·L-1時抑制率最高［(78.4 ± 0.81)%，IC50190.1 μmol·L-1］。48 h后，1～3對肝癌細胞生長的抑制作用同樣明顯:1在用藥量為250 μmol·L-1時抑制率最高［(68.8 ±0.76)%，IC50322.4 μmol·L-1］，2 在用藥量為 500 μmol·L-1時抑制率最高［(81.1 ±2.77)%，IC50332.5 μmol·L-1］，3 在用藥量為 250 μmol·L-1時抑制率最高［(89.5 ±0.72)%，IC50232.4 μmol·L-1］。由此可見，3對人肝癌細胞HepG2有較好的抑制作用。

3 結論

本文引入5-Fu對去甲斑蝥素的酸酐環進行結構修飾，合成了含有羧基的去甲斑蝥素衍生物，以期能研制增效減毒型的抗癌新藥。

去甲斑蝥素結構中的活性基團并不多，氧橋是斑蝥素類化合物抗癌的主要活性官能團。含有氧橋結構的化合物均對腫瘤細胞有著一定的抑制作用，但雙鍵的存在與否對化合物的抗腫瘤活性并沒有太大的影響(因1和2對HepG2的抑制活性并沒有明顯的差異)，但酸酐環開環后得到的羧酸衍生物3較1和2對HepG2的抑制活性增強，可能是由于羧基作為親水性基團，與酸酐環的穩定五元環結構相比，生物利用度更高，更易于與機體細胞結合，有較好的抗腫瘤活性。

表2 化合物對人肝癌細胞HepG2生長的抑制率Table 2 Inhibition rates of compounds to human liver cancer cell HepG2

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