響應面法優化水酶法提取林蛙卵蛋白

季曉楓， 林 鳳， 邱芳萍＊

（1.長春工業大學化學與生命科學學院，吉林長春 130012；2.吉林大學生命科學學院，吉林長春 130012）

0 引 言

林蛙是水陸兩棲動物，常在沒有強烈光照、濕潤涼爽的環境中生活，以多種昆蟲為食，9月下旬至10月初從山坡林區遷到河溝附近，陸續進入水底集群冬眠。少數在泥間或樹根下越冬，次年清明前后復蘇。林蛙渾身是寶，且可直接食用，關于林蛙油的研究報道很多，但對林蛙卵的研究和報道甚少。有報道林蛙卵富含豐富的蛋白質、脂肪、維生素、氨基酸及雄性激素睪丸酮、雌性激素孕酮、雌二醇、雌三醇和磷脂等。它具有提高免疫力、調節血脂、延緩衰老、預防婦女更年期綜合癥等功效［1－4］。以林蛙卵為原料，利用響應面法對最佳酶解條件進行了分析，為林蛙卵的開發及利用提供了理論基礎和實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮林蛙卵，購于吉林省靖宇縣；

堿性蛋白酶，活力1.2×105U／mL；

LDZ5-2型臺式低速離心機，上海安亭科學儀器廠；

二十孔消化爐，上海纖檢儀器有限公司；

KDN-04Ш型蛋白質測定儀，上海纖檢儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分析檢測方法

水分的測定：依據GB5009.3-2010。

粗脂肪的測定：依據GB／T14772-2008。

粗蛋白的測定：依據GB5009.5-2010。

灰分測定：依據GB／T5505-2008。

1.2.2 工藝流程

新鮮林蛙卵→干燥粉碎→配液→調pH和溫度→蛋白酶酶解→升溫滅酶→過濾得殘渣→測殘蛋白→調pH和溫度→活性炭脫色→過濾→離心分離→水解液噴霧干燥。

1.2.3 操作要點

取50g新鮮林蛙卵粉干燥粉碎，按一定比例加入蒸餾水，置于恒溫水浴鍋中并利用攪拌器進行不斷攪拌，用稀釋的NaOH溶液調節pH值，并加入一定量的堿性蛋白酶，在恒溫下進行酶解，經過一定時間后，升溫至100℃滅酶5min，過濾殘渣，最后進行離心分離，得水解液，噴霧干燥得到林蛙卵蛋白。林蛙卵蛋白提取率計算如下：

1.2.4 堿性蛋白酶提取林蛙卵蛋白的單因素實驗

1）加酶量對林蛙卵蛋白提取率的影響。按1.2.3所述方法，料液比分別為1∶6，酶解溫度為50℃，酶解時間為3h，pH值為9，加酶量分別選取0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%。

2）溫度對林蛙卵蛋白提取率的影響。按1.2.3所述方法，料液比為1∶6，酶解溫度分別為40，45，50，55，60，65℃，酶解時間為3h，pH值為9，加酶量選取2%。

3）時間對林蛙卵蛋白提取率的影響。按1.2.3所述方法，料液比為1∶6，酶解溫度為50℃，酶解時間分別為2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0h，pH值為9，加酶量選取2%。

4）料液比對林蛙卵蛋白提取率的影響。按1.2.3所述方法，料液比分別為1∶3，1∶4，1∶5， 1∶6，1∶7，1∶8，酶解溫度為50℃，酶解時間為3h，pH值為9，加酶量選取2%。

5）pH值對林蛙卵蛋白提取率的影響。按1.2.3所述方法，料液比為1∶6，酶解溫度為50℃，酶解時間為3h，pH值分別為7，8，9，10，11，12，加酶量選取2%。

1.2.5 堿性蛋白酶提取林蛙卵蛋白響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，確定了各因素的水平值范圍，并采用響應面中心組和試驗設計，研究各酶解參數對考察指標的影響規律。選取加酶量、酶解溫度、酶解時間、料液比和酶解pH值5個因素為自變量，以林蛙卵蛋白提取率為響應值，優化林蛙卵蛋白提取工藝的最佳參數。其因素水平編碼表見表1。

表1 響應面設計因素和水平

1.3 數據處理

采用design expert軟件對試驗數據進行分析［5－6］。

2 結果與討論

2.1 林蛙卵的主要成分

本實驗用林蛙卵的主要成分見表2。

表2 林蛙卵成分分析表 %

2.2 堿性蛋白酶提取林蛙卵蛋白的單因素實驗結果

加酶量對林蛙卵蛋白提取率的影響如圖1所示。

圖1 加酶量對林蛙卵蛋白提取率的影響

加酶量低于2%時，隨著加酶量的增加，提取率顯著上升，當加酶量達到2%時，提取率接近最大值，超過2%時，提取率的變化不明顯，趨于穩定。由于酶的價格比較昂貴，考慮到經濟效益，在提取率近乎相等的條件下，最佳的加酶量為2%。

酶解溫度對林蛙卵蛋白提取率的影響如圖2所示。

圖2 酶解溫度對林蛙卵蛋白提取率的影響

在溫度低于55℃時，林蛙卵蛋白提取率隨著溫度的升高而增加，主要由于溫度越來越接近酶的最適溫度，酶的活性增加，酶對底物的作用明顯，因此，提取率隨著溫度的升高而增加，當溫度高于55℃時，提取率隨著溫度的升高而降低，因此最適溫度為55℃。

酶解時間對林蛙卵蛋白提取率的影響如圖3所示。

圖3 酶解時間對林蛙卵蛋白提取率的影響

當時間低于4.0h時，提取率呈上升趨勢，變化程度較明顯，時間繼續增加時，提取率緩慢增加而后又略有降低，從時間合理化的出發點考慮最適酶解時間為4.0h。

料液比對林蛙卵蛋白提取率的影響如圖4所示。

圖4 料液比對林蛙卵蛋白提取率的影響

隨著料液比的降低，提取率先升高而后下降，在1∶5時出現峰值。因此最適料液比為1∶5。

pH值對林蛙卵蛋白提取率的影響如圖5所示。

由圖5可知，當pH值低于9時，隨著pH值的增加，提取率逐漸增加，當pH值為9時，提取率接近最高值，但隨著體系pH值增大，雖然提取率增加，但會帶入過多的堿，使所得的蛋白含鹽量增加，給蛋白的進一步利用帶來限制。因此最適宜的pH值為9。

圖5 pH值對林蛙卵蛋白提取率的影響

2.3 堿性蛋白酶提取林蛙卵蛋白響應面試驗結果

在單因素實驗的基礎上，綜合考慮經濟效益及林蛙卵蛋白品質，確定各因素的最佳水平值范圍，采用響應面中心組和試驗設計，研究各酶解參數對考察指標的影響規律，并得到酶解的最佳條件［7］。以各酶解工藝參數加酶量A、酶解溫度B、酶解時間C、料液比D、pH值E為自變量，以提取率為響應值。響應面實驗方案及結果見表3。

表3 響應方案及結果

續表3

2.4 堿性蛋白酶提取林蛙卵蛋白響應面試驗結果分析

通過統計分析軟件design expert進行數據分析，建立二次響應面回歸模型如下：

進一步對該回歸模型進行顯著性檢驗，響應曲面數據的方差分析結果見表4。

表4 回歸與方差分析結果

由表4可知，AB，AC，AD，CD，DE，CE模型顯著，方程因變量與自變量之間的線性關系明顯，該模型回歸顯著（p＜0.001），失擬項不顯著，并且該模型R2＝99.92%，R2Adj＝99.86%，說明該模型與實驗擬合良好，自變量與響應值之間線性關系顯著，試驗誤差小，可以用該方程代替真實試驗點進行分析。按照得到的數學模型繪制響應曲面，如圖6所示。

圖6 各因素交互作用對提取林蛙卵蛋白提取率影響的響應面

2.5 條件優化

由F檢驗可以得到因子貢獻率為：A＞D＞B＞C＞E，即加酶量＞料液比＞酶解溫度＞酶解時間＞酶解pH值。利用響應面軟件對邊界值和求得的極值進行分析，得到最佳提取條件為：加酶量1.9%，溫度58℃，酶解時間4h，料液比1∶5，pH值8.8。在響應面分析法求得的最佳條件下進行平行實驗（3次），平均值為9.63%。響應值的實驗值與回歸方程預測值吻合良好，說明該模型能夠較好地預測實際林蛙卵蛋白提取率情況［8］。

3 結 語

本試驗選用堿性蛋白酶提取林蛙卵蛋白，利用響應面進行優化，使得林蛙卵蛋白的提取率達到最佳。本試驗為校企合作研制和開發林蛙卵蛋白的相關產品提供了理論依據，為其大規模工業化生產奠定了基礎。本研究將從更大的深度上挖掘長白山林蛙資源，開發新的終端產品，增加林蛙加工品種，促進長白山林蛙亞種產業系的現代化、高值化發展。

［1］ 胡曉丹，李波.哈士蟆的價值及利用［J］.中國食物與營養，2001（2）：272-280.

［2］ 金莉莉，劉德文，范文今，等.中國林蛙卵、卵油及輸卵管對紅細胞SOD活性的影響［J］.中國公共衛生，2002，18（5）：607.

［3］ 邱芳萍，周杰.從吉林林蛙干皮中提取抗菌肽［J］.吉林工學院學報：自然科學版，2002，23（2）：4-6.

［4］ 程玉華.林蛙卵及其應用：中國，CN99119379.2［P］. 2001-03-21［2012-10-25］.http：／／211.157.104.87：8080／sipo／zljs／hyjs-yx-new.jsp？recid＝CN99119379.2＆leixin＝fmzl＆title＝林蛙卵及其應用＆ipc＝A61K35／54.

［5］ 蘇曉雨，王振宇，李穎.超聲輔助提取松仁蛋白工藝的響應面法優化［J］.食品研究與開發，2008，29（12）：45-49.

［6］ 麻成金，吳竹青，傅偉昌，等.響應面法優化仿栗籽油超臨界萃取工藝［J］.食品科學，2010，31（18）：196-202.

［7］ 邱芳萍，王長周，季曉楓.柱前衍生RP-HPLC法測定林蛙皮膠原蛋白肽中18種氨基酸含量［J］.長春工業大學學報：自然科學版，2012，33（5）：583-587.

［8］ 房天琪，邱芳萍，王長周，等.蛹蟲草菌絲體液體培養工藝的研究［J］.長春工業大學學報：自然科學版，2011，32（1）：83-87.