CYP2C9和VKORC1基因多態性對華法林穩定劑量的影響

武建才，趙克斌，胡 敏

華法林是一種香豆素類口服抗凝藥，具有抗凝和溶栓的雙重作用。但由于華法林抗凝治療窗窄，抗凝不當很容易導致出血或栓塞，甚至危及病人生命。因此，如何在臨床上合理有效使用華法林長期以來一直是臨床醫生關注的重點和難點。近年來隨著藥物基因組學研究的不斷深入，大量研究表明，CYP2C9和VKORC1基因多態性是造成個體間華法林穩定劑量差異的主要原因，故本研究旨在結合非遺傳因素探討山西地區漢族人群CYP2C9＊3（1075A＞C）和 VKORC1（-1639G＞A）基因型分布特點及對華法林日均維持劑量的影響，從而輔助臨床醫生指導患者個體化華法林的使用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2012年1月——2012年7月到山西醫科大學第一醫院復查抗凝指標的服用華法林抗凝患者179例（病例組），其中男84例，女95例，年齡（53.93±12.12）歲，體重指數（BMI）22.61 kg／m2±3.40 kg／m2。對照組為同期到我院門診健康體檢者150名，男72名，女78名，年齡（52.98±13.20）歲，所有入選對象均來自山西地區的漢族居民，相互間無血緣關系及異族通婚史。入選標準：年齡≥18歲、穩定抗凝超過1個月、國際化標準比值（INR）1.7～3.0［1］。排除標準：肝腎及甲狀腺功能不全、營養不良或懷孕者、服用可能與華法林有相互作用藥物（如胺碘酮、維生素K抑制劑等）的患者、有凝血功能障礙、華法林過敏者。

1.2 試驗方法

1.2.1 標本采集及處理 在受試者知情同意的前提下，采集服藥后空腹12 h外周靜脈血3 m L（枸櫞酸鈉抗凝），用于檢測CYP2C9＊3（1075A＞C）和VKORC1（-1639 G＞A）基因型，全血標本-20℃保存。同時采集患者的基本資料：年齡、性別、身高、體重、病因、伴隨藥物、使用華法林劑量及最近3次所測INR值等，計算BMI。INR值測定結果由山西醫科大學第一醫院檢驗科生化室提供。基因組DNA提取采用全血基因組DNA提取試劑盒（購自天根生化科技有限公司），將提取好的基因組DNA-20℃保存。

1.2.2 擴增阻滯突變體系-聚合酶鏈式反應技術（ARMS-PCR）法擴增 本研究所采用的ARMS-PCR引物和探針序列由北京鑫諾美迪基因檢測技術有限公司提供，委托生物工程（上海）有限公司合成、純化。采用25μL ARMS-PCR擴增反應體系：PCR反應液12.5μL，引物探針混合液6.5μL，超純水4μL，基因組DNA 2μL。反應儀器：美國安捷倫 Mx3000熒光定量PCR儀。反應條件：95℃預變性3 min，94℃變性15 s，60℃退火延伸35 s，共40個循環。

1.3 統計學處理 所有統計數據均用SPSS 13.0統計軟件分析，計數資料采用卡方檢驗，計量資料用均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗或秩和檢驗，對患者和健康受試者的基因型頻率比較采用Fish精確檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 入選患者基本特征（見表1）

表1 入選患者基本臨床特征

2.2 兩組基因型及等位基因頻率分布

2.2.1 CYP2C9＊3（1075A＞C）基因型及等位基因頻率分布在入選的329例中，CYP2C9＊3（1075A＞C）AA型293例（89.1%），AC型33例（10.0%），AC型3例（0.9%），說明中國漢族人群中CYP2C9＊3（1075A＞C）以AA型為主。等位基因A和C的頻率分別為94.1%和5.9%，說明在中國漢族人群中以等位基因A為主。兩組間CYP2C9＊3（1075A＞C）基因型及等位基因頻率分布比較差異無統計學意義（P＞0.05），可認為正常人和患者之間SNP分布無差異。詳見表2。

表2 CYP2C9＊3（1075A＞C）基因型及等位基因頻率比較 例（%）

2.2.2 VKORC1（-1639 G＞A）基因型及基因頻率分布 在入選的329例中，VKORC1（-1639 G＞A）AA型278例（84.5%），GA型51例（15.5%），未發現GG型，說明在中國漢族人群中VKORC1（-1639 G＞A）基因以AA型分布為主。A和G的等位基因頻率分別為92.3%和7.7%，說明在中國漢族人群中以等位基因A為主。兩組間VKORCL（-1639G＞A）基因及等位基因頻率比較差異無統計學意義（P＞0.05），可認為正常人和患者之間SNP分布無差異。詳見表3。

表3 VKORC1（-1639 G＞A）基因型及等位基因頻率比較 例（%）

2.3 年齡、性別、體重指數及基因多態性與華法林穩定劑量的關系 由于本研究中華法林日均穩定劑量不符合正態分布，所以對CYP2C9＊3（1075A＞C）、VKORC1（-1639G＞A）和性別采用非參數檢驗，其Mann-Whitney U統計量分別為121 5，P＜0.05；882.5，P＜0.05；3 401.5，P＞0.05。因此可以認為CYP2C9＊3（1075A＞C）和 VKORC1（-1639G＞A）基因多態性與華法林穩定劑量差異有統計學意義，不同性別間華法林穩定劑量差異無統計學意義。將年齡和體重指數與華法林穩定劑量做相關性分析顯示，年齡與華法林穩定劑量呈負相關（r＝-0.186，P＜0.05），體重指數與華法林穩定劑量無明顯相關（r＝-0.007，P＞0.05）。

因為CYP2C9＊3（1075A＞C）CC型發現例數只有2例，為便于分析將其與AC型合并成一組，分析發現：CYP2C9＊3（1075A＞C）（AC＋CC）型華法林日均穩定劑量（2.35±1.13）mg／d明顯低于 AA型（2.92±1.11）mg／d（P＜0.05），兩組間年齡、性別、體重指數差異無統計學意義（P＜0.05）。VKORC1（-1639G＞A）AA型華法林穩定劑量（2.72±1.00）mg／d明顯低于GA型（3.84±1.46）mg／d（P＜0.05），兩組間年齡、性別、體重指數差異無統計學意義（P＜0.05）。不同基因型間華法林穩定劑量比較詳見表4。

表4 不同基因型患者華法林日均穩定劑量比較

3 討 論

華法林作為一線口服抗凝藥，目前在臨床上仍被廣泛使用，研究表明，不同患者使用華法林的劑量可以相差20倍［2］，造成華法林維持劑量差異的原因包括遺傳因素和非遺傳因素，近年來研究表明，VKORC1和CYP2C9基因多態性是影響華法林劑量個體差異的主要遺傳因素，這兩個基因可解釋40%左右華法林的個體劑量差異［3］。故本研究結合非遺傳因素（年齡、性別、BMI）探討了山西地區漢族人群CYP2C9＊3（1075A＞C）和VKORC1（-1639G＞A）基因多態性分布特點及對華法林穩定劑量的影響。

INR的目標值將直接決定著患者所需華法林的劑量，因我國采用INR監測抗凝效果比較晚，目前在華法林的抗凝強度、抗凝監測方面還不完善［4］，本研究在綜合相關文獻的基礎上將納入患者的目標INR值定為1.7～3.0，且所有入選患者在服用華法林的過程中均未發生栓塞或出血等不良事件［5］。

本研究采用ARMS-PCR法對150名健康人群和179例服用華法林患者基因型檢測發現，正常人和患者之間CYP2C9＊3（1075A＞C）和VKORC1（-1639G＞A）的SNP分布無差異，與李勝軍等［6］在江蘇地區的研究結果一致。本研究結果顯示，CYP2C9＊3（1075A＞C）基因及等位基因頻率分布，與國內外報道基本一致，可以認為CYP2C9＊3（1075A＞C）基因及等位基因分布無明顯的人種差異［7］。VKORC1（-1639G＞A）基因及等位基因頻率分布與國內馬心超等［8］報道結果基本一致，而與國外 Geiser等［9］報道的結果相反，可見在不同種族間VKORC1（-1639 G＞A）基因型分布存在人種差異，亞洲人群中AA型居多，而在白種人中GG型居多。

另外，本研究中入選的179例患者所服用的華法林穩定劑量從0.75 mg／d到7.4 mg／d不等，個體間劑量差異可達十余倍，進一步提示華法林穩定劑量個體差異較大。CYP2C9＊3（1075A＞C）（AC＋CC）型華法林日均穩定劑量較AA型降低了19.5%，VKORC1（-1639G＞A）AA型華法林穩定劑量較GA型降低了26.9%，與國內外文獻報道基本一致［10］，進一步提示CYP2C9＊3（1075A＞C）和 VKORC1（-1639G＞A）的基因變異會導致個體間華法林穩定劑量的差異，而且進一步證明了VKORC1基因的變異造成個體間華法林穩定劑量差異的作用更大［11］。

在影響華法林維持劑量的非遺傳因素中研究發現年齡與華法林日均穩定劑量呈負相關，與文獻報道結果一致［12］，其原因可能為隨著年齡的增長，個體的肝腎功能及代謝能力降低，合成凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ能力減退，肝細胞色素P450酶含量及活性逐步下降，血漿蛋白結合率及華法林代謝清除率有所降低，從而導致了高齡患者所需華法林劑量的減少。性別和體重指數與華法林日均穩定劑量無明顯相關，其原因可能是由于本研究所選樣本量較小或所選樣本單一有關，所以今后的研究需要加大樣本量并拓寬入選人群進行研究。

綜上所述，年齡以及CYP2C9＊3（1075A＞C）和VKORC1（-1639G＞A）基因多態性對中國漢族人群華法林穩定劑量具有顯著的影響，臨床醫生在用藥之前參考這些變量可以指導患者個體化華法林的使用，對臨床提高華法林的安全使用具有潛在的價值。

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