潰瘍性結腸炎模型建立的研究進展

魯 兵，余萬桂 （長江大學醫學院，湖北 荊州434023）

吳國棟 （荊州市第二人民醫院消化內科，湖北 荊州434000）

潰瘍性結腸炎 （UC）在我國屬于高發常見疾病，其發病原因仍然未明確。潰瘍性結腸炎動物模型的建立對研究疾病的發展進程、預防治療具有重要意義。一直以來潰瘍性結腸炎動物模型根據不同的研究需要采取了不同的制備方法［1-3］，對此，我們將其研究進展進行如下綜述。

1 化學造模法

1．1 乙酸造模法

乙酸造模法是根據化學刺激腸壁黏膜屏障產生炎癥機制，利用花生四烯酸代謝異常環節介導此反應［4］，由于大鼠模型的炎癥反應與人類的相似［5］，并且材料來源豐富，制備簡單，成功率高，故而該模型運用廣泛。Cetinkaya［6］將乙酸注入大鼠結腸后用生理鹽水給予沖洗2次，大鼠隨即出現腹瀉血便等結腸炎癥表現，但是癥狀只持續1周。因此乙酸制備出的大鼠UC模型在研究中具有局限性，目前該模型主要用于研究UC的發病機制和炎癥的自愈機制。該模型的研究局限性與其制備方法、模型特點有很大的關系，首先乙酸的刺激部位主要是結腸末端腸粘膜及血管，與人類發病機制有一定的區別；其次乙酸的刺激性小，大鼠模型的臨床癥狀不能長期持續，導致藥物療效的觀測不穩定，大鼠自身自愈性與藥物療效很容易混淆，因而無法對藥物療效做出長期的穩定性評價。

1．2 角叉菜膠造模法

紅海藻提取的硫酸多精損傷結腸上皮細胞結構，增加腸壁黏膜的通透性，該模型主要適用于急性期盲腸炎癥病變的防治藥物的觀察和篩選，大鼠飲用3%角叉菜膠溶液出現UC癥狀的時間為2周后，盲腸、結腸、直腸于3周后肉眼可見針尖大小的潰瘍和出血點，隱窩膿腫、變形，黏膜潰瘍形成，黏膜和黏膜下層炎性細胞滲出在組織學可發現。但是該模型的缺陷是不能持久保持UC模型的臨床特點，因此需要反復造模，成本較高［7］。

1．3 葡聚糖硫酸鈉 （DSS）造模法

DSS的制備與巨噬細胞功能失調、腸道菌群失調和DSS的負電荷影響結腸上皮DNA合成、抑制上皮細胞增生、破壞腸黏膜屏障有關［8］，BALB／c小鼠自由飲用5%DSS溶液5d就可以制備出遠端結腸潰瘍的急性炎癥模型，其產生的臨床癥狀、病理切片表現，以及疾病的預后轉歸與人UC相似，廣泛用于篩選對UC有治療潛力的藥物研究。

1．4 過氧化亞硝酸鈉 （NaOONO2）造模法

Daniel等［9］在1993年成功地應用過氧化亞硝酸鈉誘導大鼠潰瘍性結腸炎模型，該方法利用氮氧化機制原理反映潰瘍性結腸炎發病機制，由于其制作簡單，重復性好，制作成本低廉，在觀察調控一氧化氮及中藥復方抗氧化作用方面一直到今天還在沿用。

1．5 三硝基苯磺酸 （TNBS）造模法

大鼠克隆氏病模型于1984年由Morris等［10］用TNBS成功地制造出。鄭禮［11］認為一次性注入直腸100～150mg／kg劑量下引起的UC組織呈慢性炎癥變化，病程較長，與人類UC相似的結論是通過對不同劑量的TNBs引起的大鼠UC模型觀察得出的，此方法具有操作簡單、經濟實用、造型時日短等特點，適用于對防治藥物的篩選和探究。

1．6 二硝基氯苯 （DNCB）造模法

DNcB做為半抗原與組織蛋白結合成完全抗原，激發機體產生E細胞介導的細胞免疫反應［12］。該模型最先用豚鼠由Bick等建立，其后Rabin等［13］對其進行了改進。DNCB模型可以反映外源性抗原和機體自身抗原誘發的典型的胃腸道遲發過敏反應，主要用于揭示UC局部遲發過敏反應的免疫調控的發病機理，但DNCB具有自愈性強的缺點。

2 免疫造模法

2．1 同種異體或異種異體結腸粘膜組織致敏法

將實驗大鼠的結腸粘膜組織制成勻漿并添加Frend佐劑，在其后1d和15d分別注射0．1～0．3ml到足墊內，在23d后通過隨機抽樣，然后解剖實驗動物觀察結腸的病理改變，若不滿意需繼續注射1次，以便產生典型UC模型。該實驗的關鍵在于Frend佐劑的制造，特別是在研碎與乳化結核菌的方面。本實驗需要一定的技術及實驗設備，并且實驗周期長。但是實驗的結果接近臨床癥狀，且重復性好，是篩選抗潰瘍性結腸炎藥物的較好驗證實驗。

2．2 胎鼠結腸種植法

胎鼠結腸種植法［14-16］主要是借助細胞免疫反應制備出慢性炎癥的模型，在無菌的環境下獲取胎鼠結腸作為抗原，移植于同系成年鼠腎包膜下，引發宿主抗移植物反應。但是該法具有相當大的局限性，需要的周期長，技術要求高，得出的模型不一定能符合實驗要求。

2．3 大鼠結腸細菌菌株法

該法以反復刺激大鼠的免疫機制為主，制備出以大鼠正常菌群為抗原的腸混懸液進行結腸刺激，大鼠結腸壁表現出潰瘍或彌散性炎癥，同時出現細胞免疫功能降低和循環免疫復合物增多，該制備方法成功率高，產生的癥狀與臨床相似，但實驗周期長。

3 中醫證型造模法

3．1 精神刺激造模法

戴芳等［17］采取刺激大鼠打斗、禁食的方式，改變大鼠的情緒和行為，造模組大鼠情緒由穩定變為易怒繼而低落，行為狀態變為少動厭食，體質量下降等肝郁脾虛表現。韓秋艷［18］則每天束綁大鼠的后肢以限制其活動，為期3周，用5%乙酸灌注大鼠結腸或用慢性夾尾激怒加高濃度大黃灌胃法。兩個實驗均成功制備了潰瘍性結腸炎肝郁脾虛證模型。

3．2 脾虛型動物模型

3．2．1 飲食不節復制的脾虛證動物模型 王曉明等［19］根據飲食不節、疲勞過度導致脾氣虛證的理論，給予實驗大鼠大量喂食豬油、甘藍，結合大鼠在滾帶式跑步機上快跑，觀察18d后，大鼠出現體質量下降、倦怠懶動，大便不正常等脾虛證型。

3．2．2 藥物復制的脾虛模型 王曉潔等［20］選 Wistar大鼠，采用不禁水禁食的方法，灌服番瀉葉浸劑后35h，以0．5%肥皂水2ml／只灌腸沖洗，該法重復2d進行病理切片觀察，得到潰瘍模型。王玉良等［21］應用同樣的方法，灌腸之后20min后肛門注入5%冰乙酸0．11ml，3d后出現脾虛癥狀，主要表現為糞便溏爛、血便以及厭食等消化道癥狀，結腸切片顯示符合潰瘍性結腸炎的病理改變。

4 復合造模法

4．1 化學法及束縛法復合造模

谷松等［22］的實驗對象是雄性Wistar大白鼠，開始捆綁大白鼠的四肢使其1周內不能活動，在實驗前24h只給大白鼠喂水而不給其喂食物。通過肛門將NBS／乙醇液注0．125ml射入大白鼠腸內，實驗進行3周后處死實驗鼠。實驗過程各階段癥狀如下，UC造模成功后的第2天出現血便、黏液便、稀便的癥狀，并且有脫毛、消瘦、飲食減少及拖尾癥狀；第3天可在腸管黏膜觀察到糜爛面及壞死組織，并觀察到水腫和黏膜充血的情況；UC造模成功第3周時，觀察到大白鼠腸壁變厚、變狹小，并觀察到多處水腫、黏膜充血及潰爛。UC造模成功后第3天的病理學觀察可以看到，大量炎性細胞存在于黏膜下層，并可見水腫、潰瘍，第3周的病理學觀察可以見到大白鼠腸管出現慢性炎癥特征，結腸黏膜水腫現象嚴重并可觀察到大量炎性細胞。

4．2 限食限動加醋酸結腸內注射法

為制造出肝郁脾虛型的潰瘍結腸炎模型，顧立剛等［23］采取限制大鼠飲食、活動的辦法，持續3周內每天束縛大鼠8h，結腸注入5%醋酸1ml，誘發結腸潰瘍。實驗顯示大鼠模型呈現體質量減輕，大便變稀，抵抗力低下，結腸病理切片黏膜充血水腫潰爛，甚至出膿穿孔，所有表現均符合人類肝郁脾虛型結腸炎的特點。

4．3 免疫法加醋酸腸內注射造模法

吳玉泓等［24］在總結了三硝基苯磺酸模型 （TNBS）、葡聚糖硫酸鈉模型 （DSS）、唑酮 （OXZ）制備的有關潰瘍性結腸炎 （UC）實驗模型的缺點后認為，借鑒徐淑云［25］的方法，改進結腸黏膜組織致敏法加乙酸局部刺激法，制備的潰瘍性結腸炎模型才有可能與人類自然發生的UC的病變特點相似，從而更好的評價藥物治療效果。他們選取30只Wistar大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、用藥組，用結腸黏膜組織致敏法加乙酸局部刺激法建立大鼠復合潰瘍性結腸炎模型，首先選用SPF級Wistar大鼠造模，取足跖內注射抗原2mg，并且在造模的第1天、第2周再次給大鼠足跖內注射抗原2mg，第3周以及第4周給大鼠足跖內注射抗原2mg的同時在肛門內注入5%醋酸1ml。2周后用生化法檢測大鼠結腸和血清中MDA、SOD、GSH-PX、NO、TNOS，iNOS值、IL-4、TNF-α含量以及IFN-γ含量，觀察大鼠結腸變化。大鼠黏膜層出現不同程度充血、糜爛、水腫及出血，淺小潰瘍形成，潰瘍面有滲出性壞死層，潰瘍的周圍腺體擴張，黏膜下固有層局部水腫、充血，腺上皮細胞輕度增生，在2周后可發現。上述變化顯示改進制備方法后建立的大鼠潰瘍性結腸炎 （UC）的實驗模型，可以較好的模擬人類UC病變的慢性活動性特點，完全可以運用于臨床藥物評價。

5 小 結

5．1 對建立潰瘍性結腸炎動物模型的方法進行對比

隨著實驗技術的發展，潰瘍性結腸炎的模型制備方法越來越多［26-27］，乙酸、三硝基苯磺酸（TNBS），葡聚糖硫酸鈉 （DSS）、唑酮 （OXZ）等都可用于模型的制備，但是從長遠的研究中我們逐漸發現，這些材料誘導的動物模型逐漸呈現出不足，如果在制備的過程中技術不穩定，有可能制備出的是克羅恩病而不是潰瘍性結腸炎模型，即使UC模型制備是成功的，該模型也僅僅是局限于潰瘍性結腸炎的免疫學病理研究；DSS模型的整個模型制備過程需要不斷的給藥進行刺激，否則大鼠模型的癥狀會消失，無法對治療藥物的療效進行區別評價。OXZ模型與DSS模型相似，具有自我恢復的能力，而乙酸制備的急性炎癥模型，受外界誘導因素的影響大，乙酸誘導的癥狀不能長期持續，兩者都不適合進行藥物療效的觀測。而對于其他方法誘導制備的大鼠潰瘍性結腸炎的模型仍然需要在使用和觀測中不斷總結探索，希望能在長期的實踐中區分出制備方法的優劣，創建出的模型能夠與人類的潰瘍性結腸炎臨床癥狀、疾病特點接近，更好的為臨床藥物研究、疾病研究奠定基礎。

5．2 建立潰瘍性結腸炎動物模型的中醫觀點

中醫傳統醫學認為潰瘍性結腸炎的發生與情志相關、肝郁氣結有關，脾失健運是主要的病機，因此在利用大鼠造模時要注意利用情志因素作為疾病誘發的因素。

縱觀以上的多種造模方法，筆者認為免疫復合物加乙酸局部灌注、束縛刺激以及飲食失節法制備出的模型與人類發病機制機理、臨床癥狀特點較為接近，因此臨床觀察的藥物療效以及疾病發展趨勢也更為穩定可信。

［1］Lauritsen K，Laursen LS，Bukhave K，et al．Longterm olsalazine treatment：Pharmacokinetics，tolerance and effects on local eicosanoid formation in ulcerative colititsand Crhn＇s colitis［J］．Gut，1988，29：974．

［2］Campbell DES，Berglindh T．Pharmacology of olsalazine ［J］．Scand J gastroenterol，1988，23：7．

［3］Alison N，Wadworth AF．olsalazine a review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties and therapeutic potential in inflammatory bowe1disease ［J］．Drugs，1991，41（4）：647．

［4］Elson C，Cong Y，Lorerlz R，et al．New development in experimental models of inflammatory bowel diseas ［J］．Curr 0pin Gastroenterol，2004，20 （4）：360．

［5］Schmidt C，Stanmach A．Etiology and pathogenesis of inflammatory bowel disease ［J］．Minerva GastroentemIog-ica E Dietologica，2005，51 （2）：127．

［6］Cetinkaya A，Bulbuloglu E，Kurutas EB，et al．Beneficial effects of N acetylcysteine on acetic acid-induced colitis in rats ［J］．Tohoku J Exp Med，2005（206）：131-1391．

［7］Jensen BH，Anderson JO，Poulsen SS，et al．The prophylactic effect of 5-aminosalicylic acid and salazosul phapyridine on degradedcarrageenan-induced colitis in guinea pig［J］．Scand J Gastroenterol，1984，19：299．

［8］Okayama M，Tsubouchi R，Nishio H，et al．Protective effect of intrarectal administration ofrebamipide on dextran sulfate sodium-induced rat colitis ［J］．Digestion，2005（70）：2490-2491．

［9］Daniel R．Peroxyni trite-Induced Rat colitis A New ModeI of colonitis Inflammation ［J］．Gastroenterology，1993 （105）：1681-1688．

［10］Morris SG，Beck SP，Herridge MS，et al．Hapten-Induced model of chronic innammation and ulceration In the rat colon ［J］．Gastroenterology，1989，96：795．

［11］鄭禮 ．大鼠潰瘍性結腸炎模型的實驗研究 ［J］．中國藥理學報，1998，14（4）：370．

［12］Calalona WJ．A method for dinifrochlorobengene contact sensitigafion：A clinico pathological study ［J］ ．N Engl J Med，1972，286：399-402．

［13］Rabin BS，Rogers SJ．A cell-mediated immune model of inflammatory bowel disease in the rabbit ［J］．Gastroenterology，1978，75（1）：29-33．

［14］Jurjus AR，Khoury NN，Reimund JM，et al．Animal models of inflammatory bowel disease ［J］．J Pharmacol Toxicol Meth，2004，50：81．

［15］Ceredig R，Henderson DC，Nairn RC．Exper imental model of ulcerative colitis［J］．Nature，1977，266：74．

［16］Nairn RC，Savvas FR，Hocking G，et al．Immunoreactive inflammation in fetal colon implants in syngenetic adult rats ［J］ ．American Journal of Pathology，1979，96（2）：647．

［17］戴芳，唐亞平，龔超奇，等 ．肝郁脾虛證大鼠模型的研制 ［J］．甘肅中醫，2009，22（10）：699-701．

［18］韓秋艷 ．肝郁脾虛證動物模型的建立 ［J］．貴陽中醫學院學報，2001，23（3）：59-62．

［19］王曉明，易杰，廖世新，等 ．脾虛證動物模型的客觀評估 ［J］．中華中醫藥雜志，2006，21（7）：406-408．

［20］王曉潔，梁建光，萬軍利，等 ．建立大鼠脾虛型潰瘍性結腸炎病理模型的實驗 ［J］．煙臺師范學院學報：自然科學版，1999，15（2）：151-154．

［21］王玉良，謝杰，李顯華，等 ．固本益腸片治療實驗性豚鼠脾虛型潰瘍性結腸炎的研究 ［J］．中國中西醫結合雜志，1995，15（2）：98-100．

［22］谷松，關慶增，明彩榮，等 ．潰瘍性結腸炎肝郁大鼠模型的實驗研究 ［J］．遼寧中醫雜志，2005，32（11）：1210-1211．

［23］顧立剛，郭學志，王慶國 ．大鼠潰瘍性結腸炎肝郁脾虛證模型的研究 ［J］．北京中醫藥大學學報，1999，22（2）：21-23．

［24］吳玉泓，李海龍，段永強，等 ．免疫致敏結合局部乙酸刺激法建立大鼠潰瘍性結腸炎模型 ［J］．中國實驗動物學報，2010，18（1）：65-68．

［25］徐淑云，卞如濂，陳修，等 ．藥理實驗方法學 ［M］．3版 ．北京：人民衛生出版社，2002：35．

［26］Mann NS，Demers LM．Experimental colitis studied by colonoscopy in the rat：effect of indomethacin ［J］ ．Gastrointest Endosc，1983，29：77-82．

［27］Onderdonk AB，Steeves RM，Cisneros RL，et al．Adoptive transfer of immune enhancement of experimental ulcerative colitis ［J］．Infect Immun，1984，46：64-67 ．