杜仲MEP途徑系列基因5′端非編碼區的順式作用元件預測

烏云塔娜，劉慧敏，杜紅巖

(1.中國林業科學研究院 經濟林研究開發中心，河南 鄭州 450003；2.國家林業局杜仲工程技術研究中心，河南鄭州 450003；3.中南林業科技大學 a.經濟林育種與栽培國家林業局重點實驗室；b.林學院，湖南 長沙 410004)

杜仲Eucommia ulmoidesOlive是我國特有的經濟樹種，屬國家二級保護植物，其樹葉、樹皮、果實均含豐富的杜仲膠，杜仲皮為中藥上品，也是我國傳統的出口創匯商品之一[1-4]。杜仲膠在國際上被稱為古塔波膠，其化學結構式為反式-聚異戊二烯(C5H8)n，是普通天然橡膠巴西橡膠的同分異構體[5]。杜仲膠高彈性體具有“橡膠-塑料”雙重特性和形狀記憶等特殊功能[6]，能廣泛應用于交通、通訊、醫療、電力、國防、水利、建筑和人們的日常生活中，其產業化前景十分廣闊[7-9]。

植物中用于不同萜類化合物合成的前體物異戊烯基二磷酸（isopentenyl diphosphate,IPP）和二甲烯丙基二磷酸（dimethylallyl diphosphate,DMAPP）在質體中主要是由2-C-甲基-D-赤蘚糖醇 -4-磷 酸（2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphate,MEP）途徑合成的[10-12]。該途徑的終產物IPP是許多萜類物質（包括杜仲膠）的前體物，該途徑涉及到多種酶的參與，許多基因受到多基因編碼和轉錄水平的調節。基因中的5′段非編碼區存在著與轉錄相關的序列，包括啟動子、增強子、應答軟件等順式作用元件及一些常見的組件TATA盒、CAAT盒等調節組件，是調控翻譯的一個重要組成部分。目前無論是在人、動物還是在植物、真菌中均有關于5′端非編碼區的研究。2012年高震[13]對小麥屬和山羊草屬Waxy基因5′端非編碼區序列的變異進行了分析，采用了PCR克隆、聚類分析、系統進化分析等方法深入了解了小麥屬和山羊草屬Waxy基因5′端的變異，為進一步了解Waxy基因的功能和調節機制，以及利用小麥屬和山羊草屬基因資源奠定基礎。2013年Wenjing Wu[14]等人通過將一段2.0 kb的5′非編碼區的片段克隆到熒光素酶報告基因載體上，缺失和突變分析表明Ets-2結合位點是尿路上皮癌抗原1（UCA1）基因啟動子或活性的關鍵。Keunsub Lee[15]等對利用轉錄組序列土壤農桿菌A.tumefaciens C58進行轉錄起始位點定位分析發現其5′端非編碼區的長度超過60 nt，表明有大量的順式作用元件被編碼在土壤農桿菌的基因組中。

1 材料與方法

1.1 序列來源

本研究所用數據資料來自杜仲膠合成時期的轉錄組數據和杜仲全基因組測序數據。

1.2 分析方法

利 用 PLANTCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線軟件預測MEP途徑系列基因5′端非編碼區中的順式作用元件，用PLACE（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html）在線軟件做輔助分析。

2 結果與分析

2.1 杜仲MEP途徑EuDXS基因5′端非編碼區順式作用元件結構和功能預測

將1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因（EuDXS2）的5′端非編碼區序列提交到在線軟件PLANTCARE和PLACE中，預測EuDXS2基因5′端可能存在的順式作用元件。結果表明：EuDXS2基因5′端非編碼區共有22種共220個順式作用元件，不僅包括啟動子順式元件TATA-box、CAAT-box等，還包括光應答、熱脅迫、干旱誘導、類黃酮生物合成、胚乳表達、糖抑制、真菌誘導、乙烯應答等多種元件；EuDXS2基因5′端非編碼區包含TATA-box可能的位點有145個，占總元件的65.91%；CAAT-box可能的位點有39個，占總元件的17.73%（見表1）。

2.2 杜仲MEP途徑EuDXR基因5′端非編碼區順式作用元件結構功能預測

將1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶基因（EuDXR）的5′端非編碼區序列提交到在線軟件PLANTCARE和PLACE中，預測EuDXR基因5′端可能存在的順式作用元件。結果表明：EuDXR基因5′端非編碼區共有21種共127個順式作用元件，包括CAAT-box、TATA-box等元件，還涉及到光應答、厭氧感應、乙烯響應、赤霉素響應、熱脅迫、干旱誘導、胚乳表達、水楊酸響應等多種方面。順式元件中包含27個CAAT-box，占總元件的21.26%；68個TATA-box，占總元件的53.54%（見表2）。

2.3 杜仲MEP途徑EuCMK 基因5′端非編碼區順式作用元件結構功能預測

將4-（5′-焦磷酸胞苷）-2-C-甲基 -D-赤蘚醇激酶基因（EuCMK）的5′端非編碼區序列提交到在線軟件PLANTCARE和PLACE中，預測EuCMK基因5′端可能存在的順式作用元件。結果表明：EuCMK基因5′端非編碼區共有24種共134個順式作用元件，包括CAAT-box和TATA-box等順勢元件，此外還涉及到光應答、胚乳表達、熱脅迫、防御和應激、乙烯響應、干旱誘導、莖特異表達、晝夜調節等多種方面。預測出32個CAAT-box，占總元件的23.88%；68個TATA-box，占總元件的50.75%（見表3）。

表1 EuDXS2基因5′端順式作用元件分布Table 1 Distribution of the cis-acting elements in non-coding region of EuDXS2 5′end

表2 EuDXS2基因5′端順式作用元件分布Table 2 Distribution of the cis-acting elements in non-coding region of EuDXR 5′end

表3 EuCMK基因5′端順式作用元件分布Table 3 Distribution of the cis-acting elements in non-coding region of EuCMK 5′end

2.4 杜仲MEP途徑EuMDS基因5′端非編碼區順式作用元件分析

將2-甲基-D-赤蘚醇-2,4-環焦磷酸合酶基因（EuMDS）的5′端非編碼區序列提交到在線軟件PLANTCARE和PLACE中，預測EuMDS基因5′端可能存在的順式作用元件。結果表明：EuMDS基因5′端非編碼區共有30種共104個順式作用元件，包括CAAT-box和TATA-box等順式元件，此外還涉及到光應答、脫落酸響應、厭氧感應、真菌誘導、分生組織、胚乳表達、熱脅迫、低溫響應、糖抑制、晝夜調節等多種方面。預測出43個CAAT-box，占總元件的41.35%；23個TATA-box，占總元件的23.08%（見表4）。

2.5 杜仲MEP途徑EuHDS基因5′端非編碼區順式作用元件分析

將1-羥基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸合酶基因（EuHDS）的5′端非編碼區序列提交到在線軟件PLANTCARE和PLACE中，預測EuHDS基因5′端可能存在的順式作用元件。結果表明：EuHDS基因5′端非編碼區共有35種共126個順式作用元件，包括TATA-box和CAAT-box等順式元件，此外還涉及到光應答、脫落酸響應、木質部表達、厭氧感應、真菌誘導、茉莉酸響應、缺氧反應、熱脅迫、胚乳表達、分生組織活性、防御和應激、晝夜調節等多種方面。預測出29個CAAT-box，占總元件的23.02%；34個TATA-box，占總元件的26.98%（見表5）。

2.6 杜仲MEP途徑EuHDR基因5′端非編碼區順式作用元件分析

將1-羥基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸還原酶基因（EuHDR）的5′端非編碼區序列提交到在線軟件PLANTCARE和PLACE中，預測EuHDR基因5′端可能存在的順式作用元件。結果表明：EuHDR基因5′端非編碼區共有24種共115個順式作用元件，包括TATA-box和CAAT-box等順式元件，此外還涉及到光應答、真菌誘導、分生組織活性、茉莉酸響應、胚乳表達、熱脅迫、干旱誘導、防御和應激反應、水楊酸響應、生長素響應等多種方面。預測出19個CAAT-box，占總元件的16.52%；67個TATA-box，占總元件的58.26%（見表6）。

表4 EuMDS基因5′端順式作用元件分布Table 4 Distribution of the cis-acting elements in non-coding region of EuMDS 5′end

3 結論與討論

以杜仲轉錄組數據和基因組數據為基礎，預測了杜仲MEP途徑6條酶基因5′端非編碼區中可能存在的順式作用元件，為從分子水平上進一步研究MEP生物合成途徑的調控提供了理論基礎。EuDXS是MEP途徑的第1個關鍵酶，EuDXS2基因5′端非編碼區共有22種共220個順式作用元件，其中有145個TATA-box，占總元件的65.91%，39個CAAT-box，占總元件的17.73%；EuDXR是MEP途徑的第2個限速酶，EuDXR基因5′端非編碼區共有21種共127個順式作用元件，其中有27個CAAT-box，占總元件的21.26%；68個TATA-box，占總元件的53.54%；EuCMK催化MEP途徑的羧基磷酸化反應，EuCMK基因5′端非編碼區共有24種共134個順式作用元件，其中有32個CAAT-box，占總元件的23.88%；68個TATA-box，占總元件的50.75%；EuMDS催化MEP途徑的第5步酶促反應，EuMDS基因5′端非編碼

區共有30種共104個順式作用元件，其中有43個CAAT-box，占總元件的41.35%；23個TATA-box，占總元件的23.08%；EuHDS為MEP途徑的第6個作用酶，EuHDS基因5′端非編碼區共有35種共126個順式作用元件，其中有29個CAAT-box，占總元件的23.02%；34個TATA-box，占總元件的26.98%；EuHDR是MEP途徑的第3個限速酶，EuHDR基因5′端非編碼區共有24種共115個順式作用元件，其中有19個CAAT-box，占總元件的16.52%；67個TATA-box，占總元件的58.26%。此結果為用生物信息學軟件參考其它植物的序列預測的數據，5′端非編碼區的結構及功能，尤其是啟動子部分CAAT-box和TATA-box的具體位置及功能還需要在此理論的指導下通過試驗驗證。

表5 EuHDS基因5′端順式作用元件分布Table 5 Distribution of the cis-acting elements in non-coding region of EuHDS 5′end

表6 EuHDR基因5′端順式作用元件分布Table 6 Distribution of the cis-acting elements in non-coding region of EuHDR 5′end

目前，MEP途徑酶基因5′端的生物信息學研究鮮見報道，大部分研究停留在轉錄組水平。2009年李輝亮[16]等人克隆了巴西橡膠樹4-羥基-3-甲基-2-（E）-丁烯基-4-磷酸還原酶基因（HbHDR）并對其表達做了分析，得到的HbHDR長1 627 bp，編碼462個氨基酸，屬于LYTB家族，半定量RT-PCR結果顯示，乙烯誘導膠乳HbHDR的表達。2007年馬靚[17]克隆了煙草5-磷酸脫氧木酮糖還原異構酶（DXR）基因全長cDNA并對其序列做了分析，克隆得到的基因全長為1 804 bp，共編碼473個氨基酸，同源序列比對發現DXR氨基酸序列和本賽姆式煙草DXR的一致性達到97%，進化樹分析顯示煙草DXR與番茄DXR的親緣關系最近，且基本反應了10種不同植物DXR之間的進化關系。

文中對MEP途徑系列基因5′端非編碼區的順式作用元件進行了預測，為進一步研究MEP生物合成途徑中相關基因的啟動子克隆、啟動子結構和功能以及MEP途徑產物的分子調控提供了理論依據。

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