山杏嫩枝扦插生根過程中插穗內(nèi)源激素含量的變化

董勝君，劉明國，戴 菲，吳月亮，單守田，丁瑞軍

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.阜新市林業(yè)科技實(shí)驗(yàn)示范園區(qū)，遼寧 阜新 123000）

山杏Armeniaca sibirica為我國三北地區(qū)重要的生態(tài)經(jīng)濟(jì)型樹種，杏核產(chǎn)量低而不穩(wěn)的問題成為制約山杏產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要“瓶頸”[1]，從2002年以來，本課題組即開始了山杏良種選育工作，挖掘出數(shù)量眾多的優(yōu)良類型，在連續(xù)觀測和生產(chǎn)中表現(xiàn)良好。為了較大規(guī)模的實(shí)現(xiàn)良種化，有必要對這些優(yōu)良類型開展快速繁殖技術(shù)方面的研究。在快繁技術(shù)中，只有無性繁殖方式才能可靠地保持選育出來的優(yōu)良無性系母本的優(yōu)良特性[2]。而在無性繁殖中，嫁接繁殖成本較高，組培繁殖技術(shù)較為復(fù)雜，不適宜應(yīng)用于山杏大面積荒山良種造林。扦插繁殖具有保持母本優(yōu)良特性、縮短育種周期、操作簡單、效率高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，扦插繁殖中嫩枝扦插生根率較高[3-4]，可作為樹種快繁和推廣的可靠繁殖方法。但山杏為扦插難生根樹種，有關(guān)該樹種扦插繁殖技術(shù)的研究鮮見報(bào)道。2012年，董勝君等提出以IBA 900 mg/L＋NAA 600 mg/L混合激素處理山杏嫩枝插穗30 s生根效果最好，生根率為83.1%，且不同山杏無性系嫩枝扦插生根效果差異顯著[5]。在山杏扦插生根過程中，有哪些內(nèi)在因素會影響到扦插生根率和生根效果，即關(guān)于山杏扦插生根機(jī)理方面的研究也鮮見報(bào)道。2012年，董勝君等研究了山杏扦插生根過程中營養(yǎng)物質(zhì)及酶活性的變化，提出植物生長調(diào)節(jié)劑處理能夠引起插穗可溶性總糖、蛋白質(zhì)、全氮含量及相關(guān)酶（POD、PPO、IAAO）活性的變化，從而促進(jìn)插穗生根[6]。而在關(guān)于山杏扦插生根機(jī)理中，內(nèi)源激素對生根的影響未見報(bào)道。筆者以山杏嫩枝為試驗(yàn)材料，研究插穗生根過程中內(nèi)源激素的變化對生根的影響，旨在探討其扦插生根機(jī)理，為該樹種的無性繁殖提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地設(shè)于阜新蒙古族自治縣的阜新市林業(yè)科技實(shí)驗(yàn)示范園區(qū)，該地區(qū)屬溫帶半干旱季風(fēng)型大陸性氣候，年平均溫度7.2 ℃，無霜期158 d，平均降水500 mm左右。四季分明，夏短、濕熱多雨，冬長、寒冷干旱。土壤類型多為褐土，棕壤次之，其它土壤類型（包括風(fēng)沙土及輕度鹽堿土）也有少量分布。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

在2011年6月下旬，于試驗(yàn)地選取生長健壯、無病蟲害的普通山杏當(dāng)年生嫩枝作為試驗(yàn)材料，將其制成8～12 cm長、帶有2～3片葉的插穗，插穗兩端切口平滑，下端呈斜面狀。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 扦插試驗(yàn)

本試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，選擇2種植物生長調(diào)節(jié)劑或組合、2種濃度處理插穗，共計(jì)4個處理，每處理3次重復(fù)，每次重復(fù)50個插穗。4個處理分別是IBA（900 mg/L）＋NAA（600 mg/L）、IBA（700 mg/L）、NAA（700 mg/L）以及清水，插穗形態(tài)學(xué)下端2～3 cm處在其中速蘸30 s，清水為對照（CK）。另于扦插當(dāng)日每個處理多加250個插穗，用于插穗內(nèi)源激素測定。

2.2.2 內(nèi)源激素含量的測定

共取樣5次，從扦插當(dāng)日開始，之后每隔10 d取樣1次，每次取樣隨機(jī)抽取20～30根插穗，用蒸餾水將插穗清洗干凈，在插穗下切口至下切口上端1 cm處取韌皮部，每處理共計(jì)10 g，現(xiàn)場采用液氮速凍，之后放于－70 ℃超低溫冰箱中保存。采用高效液相色譜法（HPLC）測定4種內(nèi)源激素ZT、GA3、IAA、ABA的含量。

2.2.3 生根形態(tài)觀察及統(tǒng)計(jì)

扦插10 d后進(jìn)行生根形態(tài)觀測，間隔期為3 d，觀測內(nèi)容包括愈傷組織出現(xiàn)期、不定根出現(xiàn)期、不定根發(fā)生部位、根系的生長過程以及根系生長指標(biāo)，40 d后統(tǒng)計(jì)扦插生根率。

3 結(jié)果與分析

3.1 插穗生根情況

經(jīng)觀測發(fā)現(xiàn)，植物生長調(diào)節(jié)劑處理的插穗生根活躍，愈傷組織和不定根形成的時間要早于對照。山杏插穗不定根的形成可劃分為3個階段，即誘導(dǎo)階段、表達(dá)階段、伸長階段；其中誘導(dǎo)期為0～10 d，表達(dá)期為11～20 d，伸長期為21～40 d。觀察插穗的生根部位，既有皮部生根類型，也有愈傷組織生根類型，其中愈傷組織生根數(shù)量居多，因此提出山杏扦插生根類型為愈傷組織生根類型。皮部生根型形態(tài)過程變化如圖1～3所示，愈傷組織生根型形態(tài)過程變化如圖4～6所示。

在不同處理中插穗生根率見表1，其中IBA（900 mg/L）和NAA （600 mg/L）混合激素處理的插穗生根率最高，為74.1%，IBA（700 mg/L）的生根率為66.8%，NAA（700 mg/L）的生根率為52.5%，生長調(diào)節(jié)劑處理的生根率均高于對照（28.1%），經(jīng)方差分析和多重比較，3種處理與CK均存在極顯著差異。

圖1 根的誘導(dǎo)期（皮部生根型）Fig.1 Introduction period of rooting (phloem rooting type)

圖2 根的表達(dá)期（皮部生根型）Fig.2 Expression period of rooting (phloem rooting type)

圖3 根的伸長期（皮部生根型）Fig.3 Elongating stage of rooting (phloem rooting type)

圖4 根的誘導(dǎo)期（愈傷組織生根型）Fig.4 Introduction period of rooting (callus rooting type)

圖5 根的表達(dá)期（愈傷組織生根型）Fig.5 Expression phase of rooting(callus rooting type)

圖6 根的伸長期（愈傷組織生根型）Fig.6 Elongation stage of rooting (callus rooting type)

3.2 生根過程中內(nèi)源激素的變化

3.2.1 IAA含量的變化

在生根過程中，不同處理插穗內(nèi)源激素IAA的含量見表2。從表2和圖7可以看出，在3種處理的插穗中，其IAA含量有相近的變化規(guī)律，均呈“升高—降低—升高”的變化趨勢，峰值均在扦插后10 d和40 d，即在根的誘導(dǎo)和伸長階段出現(xiàn)，而CK在扦插后20 d出現(xiàn)峰值。同一時期各處理IAA含量比較，差異較大的時期出現(xiàn)在扦插后10 d和40 d，扦插后10 d時IBA＋NAA、IBA和NAA處理的插穗IAA含量比CK分別提高53.3%、34.7%和25.8%，扦插后40 d時比CK分別提高65.7%、56.6%和28.2%，誘導(dǎo)和伸長階段處理插穗的IAA含量與CK均存在極顯著差異，且3種處理的生根率均高于CK，IAA含量（10 d）與生根率的相關(guān)系數(shù)為0.979，在0.05水平呈顯著正相關(guān)，表明生長調(diào)節(jié)劑處理有利于促進(jìn)山杏插穗IAA的合成，縮短誘導(dǎo)時間，且IAA對根原基的形成有重要作用。

表1 不同處理中插穗生根率Table 1 Rooting rate of cuttings in different treatments %

3.2.2 ABA含量的變化

在生根過程中，不同處理插穗內(nèi)源激素ABA的含量見表3。由表3和圖8可知，3種處理與CK的ABA含量變化趨勢一致，均在誘導(dǎo)階段下降，表達(dá)階段有回升，伸長階段再下降，總體呈現(xiàn)波動下降的趨勢，且在誘導(dǎo)階段下降明顯。比較圖7可以看出，在誘導(dǎo)階段和表達(dá)階段，3種處理的ABA含量與IAA含量此消彼長，變化趨勢相反。各處理依ABA含量由高到低排列依次為CK、NAA、IBA、IBA＋NAA，誘導(dǎo)階段處理插穗的ABA含量與CK均存在極顯著差異，ABA含量與生根率的相關(guān)系數(shù)為－0.994，在0.01水平呈極顯著負(fù)相關(guān)，這表明高水平的ABA能抑制不定根的形成和生長。

表2 不同處理插穗生根過程中內(nèi)源激素IAA含量Table 2 Content of endogenous hormone IAA during cutting rooting process in different treatments μg/g

圖7 山杏插穗IAA含量的變化Fig.7 Changes of IAA content in cuttings of Armeniaca sibirica

表3 不同處理插穗生根過程中內(nèi)源激素ABA含量Table 3 Content of endogenous hormone ABA during cutting rooting process in different treatments μg/g

3.2.3 ZT含量的變化

在生根過程中，不同處理插穗中內(nèi)源激素ZT的含量見表4。由表4和圖9可以看出，各處理插穗中ZT含量均呈現(xiàn)先升高、后降低的變化趨勢，且在根的表達(dá)階段末期（20 d）出現(xiàn)峰值。IBA＋NAA、IBA和NAA處理的ZT含量峰值比CK分別低34.2%、27.3%和9.1%，且與CK均存在極顯著差異。各處理按ZT含量由高到低排列依次為CK、NAA、IBA、IBA＋NAA，ZT含量（20 d）與生根率的相關(guān)系數(shù)為－0.989，在0.05水平呈顯著負(fù)相關(guān)。在誘導(dǎo)階段和表達(dá)階段，生根率最高的混合處理插穗的ZT含量最低，與CK存在極顯著差異，表明此期高水平的ZT含量對生根起抑制作用。在生根的每個階段，混合處理的ZT含量均為最低的，且與對照均存在極顯著差異。

圖8 山杏插穗ABA含量的變化Fig.8 Changes of ABA content in cuttings of Armeniaca sibirica

圖9 山杏插穗ZT含量的變化Fig.9 Changes of ZT content in cuttings of Armeniaca sibirica

表4 不同處理插穗生根過程中內(nèi)源激素ZT含量Table 4 Content of endogenous hormone ZT during cutting rooting process in different treatments μg/g

3.2.4 GA3含量的變化

在生根過程中，不同處理插穗內(nèi)源激素GA3的含量見表5。由表5和圖10可以看出，在誘導(dǎo)階段和表達(dá)階段，處理的GA3含量變化趨勢與CK相反，呈連續(xù)降低趨勢。CK的GA3含量明顯高于其它3組處理，而其生根率最低；3種處理生根率較高，整個生根過程中其GA3含量總體呈波動降低的趨勢，生根的各階段GA3含量均低于CK，且與CK均存在極顯著差異，表明處理可以調(diào)節(jié)植株體內(nèi)GA3含量，且低水平的GA3可促進(jìn)生根。

表5 不同處理插穗生根過程中內(nèi)源激素GA3含量Table 5 Content of endogenous hormone GA3 during cutting rooting process in different treatments μg/g

圖10 山杏插穗GA3含量的變化Fig.10 Changes of GA3 content in cuttings of Armeniaca sibirica

3.2.5 IAA/IBA與IAA/ZT的變化

在生根過程中，不同處理插穗內(nèi)源激素IAA與ABA和ZT含量的比值見表6、圖11和圖12。由表6和圖11可知，在誘導(dǎo)階段和伸長階段，3種處理插穗的IAA/ABA值均高于CK，在扦插后10 d時差異最大，各處理的IAA/ABA值分別比CK提高100.3%、51.4%和41.1%，與CK均存在極顯著的差異，且3種處理的生根率也均顯著高于CK，IAA/ABA含量（10 d）與生根率呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.878，由此表明插穗生根率隨IAA/ABA值升高而升高。不同處理的IAA/ABA值差異較大的2個時期分別為誘導(dǎo)階段和伸長階段，而此期也是扦插生根的關(guān)鍵階段，因此可以推斷IAA/ABA值對扦插生根影響明顯，且IAA/ABA值高有利于根原基的形成，這與本研究中關(guān)于IAA和ABA含量變化的結(jié)論一致。

表6 不同處理插穗生根過程中內(nèi)源激素含量比值Table 6 Ratios of endogenous hormone contents during cutting rooting process in different treatments

圖11 山杏插穗IAA/ABA的變化Fig.11 Changes of IAA/ ABA in cuttings of Armeniaca sibirica

圖12 山杏插穗IAA/ZT的變化Fig.12 Changes of IAA/ ZT in cuttings of Armeniaca sibirica

由表6和圖12可知，3種處理的IAA/ZT值變化趨勢相同，均表現(xiàn)為“升高—降低—升高”的變化趨勢，CK變化趨勢較平緩，總體呈下降趨勢。各處理的IAA/ZT值在伸長階段末期均高于CK，按照比值由高到低依次為IBA、IBA＋NAA、NAA、CK，各處理的IAA/ZT值比CK分別提高178.4%、131.6%和88.7%，與CK均存在極顯著差異，各處理的插穗生根率也明顯高于CK，IAA/ZT值與生根率呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.92，表明處理可以調(diào)節(jié)插穗IAA/ZT水平，從而影響插穗生根。

4 結(jié)論與討論

山杏嫩枝插穗生根的類型以愈傷組織生根為主，插穗生根過程包括3個階段：即誘導(dǎo)階段、表達(dá)階段和伸長階段；各階段的天數(shù)分別為誘導(dǎo)期0～10 d，表達(dá)期11～20 d，伸長期21～40 d。插穗生根過程中，植物生長調(diào)節(jié)劑處理影響內(nèi)源激素含量的變化，從而促進(jìn)插穗生根；各處理的生根率顯著高于對照，以IBA+NAA混合激素處理生根率最高，為74.1%。

處理組的IAA含量在根的誘導(dǎo)期和伸長期出現(xiàn)明顯峰值，而對照峰值出現(xiàn)較晚，扦插10 d后IBA＋NAA、IBA和NAA處理的插穗IAA含量比對照分別提高53.3%、34.7%和25.8%，扦插40 d后比對照分別提高65.7%、56.6%和28.2%，表明插穗IAA含量對根原基的誘導(dǎo)和伸長有重要作用。處理和對照的ABA含量變化總體呈波動下降的趨勢，且在誘導(dǎo)階段下降明顯，各處理的ABA含量均低于對照，說明ABA能抑制不定根的形成和生長。各處理的ZT含量均呈現(xiàn)先升高、后降低的變化趨勢，且在根的表達(dá)階段末期出現(xiàn)峰值；ZT含量與生根率呈負(fù)相關(guān)，對生根起抑制作用。各處理的GA3含量總體呈波動降低的趨勢，其中生根率高的IBA+NAA處理呈連續(xù)降低趨勢，低水平的GA3可促進(jìn)根原基的發(fā)生。在誘導(dǎo)階段和伸長階段，各處理的IAA/ABA值在誘導(dǎo)和伸長階段出現(xiàn)2次峰值，在扦插后10 d時差異最大，分別比對照提高100.3%、51.4%和41.1%，且與生根率呈正相關(guān)，高IAA/ABA值有利于根原基的形成。各處理的IAA/ZT值表現(xiàn)出明顯的“升高—降低—升高”的變化趨勢，CK變化趨勢較平緩，總體呈下降趨勢；各處理的IAA/ZT值在扦插后40 d時與對照差異最大，分別提高178.4%、131.6%和88.7%。

近年來，很多學(xué)者把不定根形成的研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向生根過程中內(nèi)源激素含量的動態(tài)變化。徐佩賢在對東方杉嫩枝扦插的研究中強(qiáng)調(diào)IAA對不定根發(fā)生具有重要作用[7]。扈紅軍在榛子扦插研究中提到，經(jīng)處理的歐榛嫩枝扦插生根過程中IAA含量的變化趨勢為“升高—降低—升高”，說明植株體內(nèi)的IAA是促進(jìn)生根因子之一[8]。劉明國在北美香柏插穗生根過程中內(nèi)源激素的變化和詹亞光在白樺大樹伐根萌條扦插試驗(yàn)中均說明IAA含量的高峰與根原基出現(xiàn)的高峰相一致[9-10]。本試驗(yàn)的研究結(jié)果與上述觀點(diǎn)一致，即IAA含量在不定根的誘導(dǎo)階段升高顯著，在山杏插穗生根前期作用明顯。詹亞光和張曉平等關(guān)于脫落酸ABA的動態(tài)變化研究中認(rèn)為，ABA含量變化呈現(xiàn)“下降—上升—下降”的變化趨勢[10-11]。關(guān)于ABA的動態(tài)變化有研究表明，ABA含量變化呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢[7,12]，本研究中結(jié)果表明，ABA含量在生根過程中總體呈下降趨勢，在生根前期表現(xiàn)得比較突出，且ABA含量與生根率成反比，表明高水平ABA能抑制不定根的形成和生長，這與上述研究結(jié)果基本一致。赤霉素和細(xì)胞分裂素類物質(zhì)對多種植物不定根的產(chǎn)生具有抑制作用[13-14]。齊永順等在比較同源四倍體玫瑰香與二倍體玫瑰香扦插生根過程中發(fā)現(xiàn)，四倍體玫瑰香插穗皮層內(nèi)的根原基誘導(dǎo)期GA3、ZT含量明顯高于二倍體，可能是導(dǎo)致其生根能力下降的原因[15]。這與本研究結(jié)果一致，但也有研究表明，ZT對插穗不定根形成的影響不明顯[16]。有研究認(rèn)為，IAA含量的動態(tài)變化與ABA是此消彼長的關(guān)系，IAA/ABA值高有利于根原基的形成，促進(jìn)生根[17-18]。此外，很多學(xué)者也認(rèn)為生長素與ABA、生長素與CTK的比值越高，對不定根形成的促進(jìn)作用越明顯[19-20]，這與本試驗(yàn)中研究結(jié)果一致。

由于不同內(nèi)源激素共存于同一植物體中，它們出現(xiàn)的時間和含量不同，還受外界條件的影響，各種激素綜合作用的結(jié)果就會產(chǎn)生一種平衡狀態(tài)[21-22]，山杏嫩枝插穗生根過程中如何達(dá)到這種平衡，有待于以后進(jìn)一步的研究。

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