油茶炭疽病與果皮中酶活性及糖類含量的關(guān)系

董傳媛，曹志華，束慶龍，胡娟娟，劉洪劍

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與園林學(xué)院，安徽 合肥 230031；2.安徽省長豐縣林業(yè)局，安徽 長豐 231100；3.安徽省林業(yè)科學(xué)研究院，安徽 合肥 230031）

油茶Camellia oleiferaAbel是集經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會(huì)效益于一體的木本油料植物，具有生長快、結(jié)果早、適應(yīng)性強(qiáng)、用途廣等特點(diǎn)，是我國重要的木本油料樹種。油茶炭疽病是制約油茶生產(chǎn)發(fā)展的一個(gè)重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，油茶炭疽病雖然常年均能發(fā)病，但生長在同一油茶園，不同品種、不同時(shí)間其發(fā)病程度大不相同，有些品種發(fā)病率高達(dá)100%，而相鄰品種幾乎不發(fā)病。目前，對(duì)于該病的防治主要是通過化學(xué)防治及選育抗病品種進(jìn)行，后者是最安全、經(jīng)濟(jì)、有效的途徑。

油茶對(duì)炭疽病的抗病機(jī)制主要與果實(shí)的表皮結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物有關(guān)。果皮組織結(jié)構(gòu)上的抗病性主要是在病菌的侵入階段起作用，是一種抵抗病菌侵入的防御手段。果色為穩(wěn)定的紫紅色和純青色的植株屬抗病的類型，抗病果實(shí)的表皮角質(zhì)層厚，細(xì)胞層多，排列緊密[1-2]，而前后期果色有變化者均屬感病類型。油茶果皮內(nèi)含物或生理生化的抗病性，主要是在病菌的擴(kuò)展階段起作用，是一種抗病菌擴(kuò)展的防御手段。油茶的抗病性與果實(shí)的糖分、花青素等含量以及苯丙氨酸解氨酶活性有關(guān)[3]。果皮內(nèi)單寧含量高，氧化酶和多酚氧化酶活性大的物種或品種，表現(xiàn)抗病；反之，則表現(xiàn)為感病[4]。高抗品種的酚類化合物和黃酮類含量顯著高于感病品種[5]。但關(guān)于油茶在生長季節(jié)果皮內(nèi)含物和生理活性物質(zhì)的變化以及與抗病性的關(guān)系的研究報(bào)道較為少見。筆者在對(duì)舒城縣油茶林炭疽病觀察研究的基礎(chǔ)上，選擇感病程度不同的植株，于5～9月發(fā)病季節(jié)，對(duì)其發(fā)病率與油茶果實(shí)的糖類含量以及酶活性等因素之間的關(guān)系進(jìn)行測(cè)定分析，以期進(jìn)一步摸清油茶對(duì)炭疽病的抗性機(jī)理，為油茶抗炭疽病的品種選育和科學(xué)防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試材料

在2006～2008年油茶的生長季節(jié)，對(duì)油茶林的發(fā)病率進(jìn)行定株、定期觀察，篩選出高抗、中抗和感病的油茶品種作為測(cè)試材料：高抗品種，簡稱“高抗”，為目前推廣的大別山1號(hào)油茶良種，發(fā)病率為2.8%；中抗品種，簡稱“中抗”，發(fā)病率為14.7%；感病品種，簡稱“感病”，發(fā)病率高達(dá)100%。不同抗病品種在生長季節(jié)的平均發(fā)病率詳見表1。

表1 在不同時(shí)期不同品種的油茶炭疽病發(fā)病率Table 1 Incidence rate of different cultivars at different stages

在生長季節(jié)，每個(gè)月的中旬采集健康無感病的果實(shí)，用濕紗布擦洗干凈放入帶有標(biāo)記的塑料袋中，立即裝入冰瓶帶回，－20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 測(cè)定儀器

高速冷凍離心機(jī)、pH測(cè)試儀、水浴恒溫振蕩器、紫外可見分光光度計(jì)、電子天平、高分辨液質(zhì)聯(lián)用分析儀等。

1.2 測(cè)定方法

多酚氧化酶活性采用焦兒茶酚法測(cè)定[6]；過氧化物酶活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[7]；苯丙氨酸解氨酶活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[8]中的方法；可溶性總糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定[9]；還原糖含量采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚氧化酶（PPO）活性與病害的關(guān)系

植物體內(nèi)的多酚氧化酶能夠氧化一元酚和多元酚類產(chǎn)生醌類化合物。感病組織由于多酚氧化酶活性增強(qiáng)和酚化物增多，使醌類物質(zhì)大量積累而出現(xiàn)組織褐變現(xiàn)象，并且對(duì)病原物造成更大的毒性[10-12]。

對(duì)3種抗病品種的油茶果實(shí)的酶活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，各油茶品種果實(shí)中PPO活性隨果實(shí)成熟度的增加均有升高的趨勢(shì)。

抗病品種果實(shí)中PPO活性增長的速度較感病品種快，尤其在5月份，抗病品種果實(shí)中PPO酶活比感病品種高出18 U·g-1min-1，感病品種從7月份開始PPO酶活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，至9月份下降了14 U·g-1min-1。各抗病品種果實(shí)中PPO酶活性之間差異顯著（P＝0.000 1）。

對(duì)不同抗病品種在不同時(shí)期果實(shí)中的PPO活性進(jìn)行雙因素統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表3。由表3可知，PPO活性在品種水平達(dá)到了極顯著差異水平（p＝0.000 1），而在不同生長時(shí)期差異不顯著（p＝0.118 2）。

2.2 過氧化物酶（POD）活性與病害的關(guān)系

在植物生長過程中果實(shí)的過氧化物酶活性總體上是呈上升趨勢(shì)，即POD活性與果實(shí)的成熟度和發(fā)病率成正相關(guān)。

表2 不同時(shí)期不同品種果皮中PPO的活性Table 2 PPO activities in peels of different varieties at different stages

表3 不同時(shí)期不同品種果皮中PPO活性的方差分析Table 3 Variance analysis of PPO activity in peel among different cultivars at different stages

POD及其同工酶在植物機(jī)體防御體系中起重要作用。POD可以清除植物細(xì)胞中有毒的H2O2，從而保護(hù)植物細(xì)胞免受毒害，防止細(xì)胞的壞死[13-14]。抗病性強(qiáng)的油茶品種其果實(shí)POD活性高于感病品種；并在感病初期，高抗品種POD活性的增長速率高出感病品種6.2%。另外，POD還參與了木質(zhì)素、酚類等抗菌物質(zhì)的合成，甚至可以直接抑制病原真菌的生長[15-17]，所以POD酶活越高，越有利于提高油茶果實(shí)的抗病性。中抗、高感品種的酶活在8月份以后均呈下降趨勢(shì)，酶活性分別下降了10、17 U·g-1min-1，可能由于細(xì)胞代謝毒素增加，導(dǎo)致保護(hù)酶的功能逐漸下降（見表4）。各抗性品種之間POD活性差異極顯著（p＝0.000 1）。

對(duì)不同抗病品種不同時(shí)期的POD活性進(jìn)行雙因素統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表5。由表5可知POD活性在品種水平達(dá)到了極顯著差異水平（p＝0.000 1），而在不同生長時(shí)期差異不顯著（p＝0.072 9）。

表4 不同時(shí)期不同品種果皮中POD的活性Table 4 POD activities in peels of different varieties at different stages

表5 不同時(shí)期不同品種果皮中POD活性的方差分析Table 5 Variance analysis of POD activity in peel among different cultivars at different stages

2.3 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性與病害的關(guān)系

植株受到病原侵染后，組織內(nèi)的防御性酶活性變化與其抗病性有密切關(guān)系，通常表現(xiàn)為抗病品種的防御性酶活性水平變化與品種抗性呈正相關(guān)關(guān)系[18-19]。

植物苯丙氨酸解氨酶是植物次生代謝的關(guān)鍵酶之一，它催化L-苯丙氨酸形成反式肉桂酸這一不可逆過程，是植物次生代謝產(chǎn)物特別是植物保衛(wèi)素和木質(zhì)素合成途徑中的定速酶，而細(xì)胞的木質(zhì)化是寄主植物對(duì)病原菌侵染的積極反應(yīng)，是阻止病原菌進(jìn)一步侵入的機(jī)械屏障，這說明PAL酶的活性強(qiáng)，則木質(zhì)素產(chǎn)生加強(qiáng)，導(dǎo)致植物抗病性的增強(qiáng)[20]。

在5月份，高抗品種果實(shí)中PAL活性分別比中抗、感病品種提高17%和30%，PAL活性與炭疽病發(fā)病率呈正相關(guān)關(guān)系（R2＝0.863 7）（見表6）。

對(duì)不同抗病品種不同時(shí)期果實(shí)中PAL活性進(jìn)行雙因素統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表7。由表7可知，PAL活性在品種水平達(dá)到了極顯著差異水平（p＝0.000 6），而在不同生長時(shí)期間差異不顯著（p＝0.192 7）。

表6 不同時(shí)期不同品種果皮中PAL活性Table 6 PAL activities in peels of different varieties at different stages

表7 不同時(shí)期不同品種果皮中PAL活性的方差分析Table 7 Variance analysis of PAL activities in peels among different cultivars at different stages

2.4 可溶性糖含量與病害的關(guān)系

各油茶品種果實(shí)的可溶性糖含量從幼果期到成熟期總體呈遞增趨勢(shì)（見圖1）。各油茶品種果實(shí)中可溶性糖含量在5～9月分別增長了60.9%、58.6%和40.0%，且5月高抗品種果實(shí)中可溶性糖含量比感病品種高45%。各油茶品種之間的果實(shí)可溶性糖含量差異顯著（p＝0.017 1），生長季節(jié)可溶性糖含量與果實(shí)發(fā)病率均呈顯著的正相關(guān)關(guān)系（R2＝0.880 2）。

圖1 果皮中可溶性糖含量與果實(shí)發(fā)病率的關(guān)系Fig.1 Relationship between soluble sugar content in peel and incidence rate of fruit

2.5 還原性糖含量與病害的關(guān)系

各油茶品種果實(shí)的還原性糖含量從幼果期到成熟期總體呈遞增趨勢(shì)（見圖2）。各油茶品種果實(shí)中還原糖含量在生長季節(jié)增加了54.5%、53.1%和47.2%，且5月高抗品種還原糖含量分別比感病品種高38%。各油茶品種之間果實(shí)的還原糖含量差異顯著（p＝0.022 2），生長季節(jié)還原糖含量與果實(shí)發(fā)病率均呈顯著的正相關(guān)關(guān)系（R2＝0.883 8）。

圖2 果皮中還原糖含量與果實(shí)發(fā)病率的關(guān)系Fig.2 Relationship between reducing sugar content in peel and incidence rate of fruit

3 結(jié)論與討論

在對(duì)舒城縣河棚鎮(zhèn)的油茶林進(jìn)行的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，同一品種發(fā)病率差異極為顯著。高抗植株果實(shí)感病率為2.8%，而高感植株果實(shí)感病率最高甚至達(dá)100%。因此，在油茶的生產(chǎn)經(jīng)營中，為達(dá)到高質(zhì)、高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的目的，首先要選擇抗病的優(yōu)良品系進(jìn)行造林。

油茶抗病品種的果皮可溶性糖含量遠(yuǎn)高于感病品種，且在生長時(shí)期含量持續(xù)增加，與楊樹、金花梨等的研究結(jié)果正好相反[21-22]，與獼猴桃、辣椒等的研究結(jié)果一致[23]。這是因?yàn)榭扇苄蕴亲鳛樾玛惔x的呼吸基質(zhì)，其含量越高，越有利于酚類化合物氧化并積累以及植保素的合成[24]，因此，可溶性糖可作為抗性指標(biāo)。

PAL是莽草酸途徑的關(guān)鍵性酶，它的活性與酚類化合物的合成密切相關(guān)；多酚的氧化與PPOD和POD有關(guān)，PPOD和POD活性的增加，可以大大增加酚類化物的含量。因此，3種酶的活性反映了酚化合物的水平，即反映了植物早期抗病性水平。在本研究中，生長期內(nèi)油茶果皮中抗病品種3種酶活性均高于抗病品種，且抗病品種酶活性的增長和合成速率均較快。表明抗病品種在受到病原物攻擊時(shí)能快速作出應(yīng)急防御反應(yīng)。

在有關(guān)過氧化物酶活性與抗病性的研究[25]中，現(xiàn)存在2種明顯不同的結(jié)論，在一些研究者的試驗(yàn)中表現(xiàn)為抗病品種比感病品種過氧化物酶活性顯著上升。認(rèn)為這是植物抵抗病原菌侵害的一種保護(hù)性反應(yīng)，它能增強(qiáng)植物對(duì)病原菌的抵抗能力。另外一些學(xué)者得到相反的結(jié)果，認(rèn)為這種現(xiàn)象只是植物在遭受病原菌的侵害后，反映在體內(nèi)生理代謝過程中的一種生化癥狀。本試驗(yàn)中所測(cè)得的氧化物酶活性與后一結(jié)論相悖，但還需要經(jīng)過更進(jìn)一步的細(xì)化試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

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