2型糖尿病葡萄糖轉運蛋白4與氧化應激的研究進展

戚琛曄,馬靈筠,席守民

氧化應激是指活性分子，例如活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)以及活性氮簇(reactive nitrogen species, RNS)等的過度生成，從而造成體內活性氧類生成與抗氧化防御功能之間平衡的紊亂。2001年Brownlee提出2型糖尿病及其血管并發癥有共同的發病機制——氧化應激，作為糖尿病及其慢性并發癥的罪魁禍首，貫穿于整個發病過程中。2 型糖尿病是一種復雜的多因素疾病，其發病與許多環境因素，包括老齡、高熱量食物攝入過度、運動量減少、肥胖等有關。近年來各方面的研究顯示，氧化應激是糖尿病及其并發癥發生發展的重要因素之一。本文就氧化應激對葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)的影響作用進行闡述。

1 GLUT4概述

GLUT4是一種分子量為45～55 kD，含509個氨基酸單一多肽鏈的糖蛋白，基本結構是由12個跨膜片段組成含有2個較大的環形結構，其中一個定位于第1、第2跨膜節段的細胞外區域，另一個定位于第6、第7跨膜節段的細胞內區域，其氨基末端及羧基末端均位于細胞膜的胞漿面。1980年就有報道說，大鼠脂肪細胞胰島素可以觸發糖轉運體從細胞內貯存到細胞質膜的易位。這種易位假說后來被證實。確定GLUT4是這些細胞中的主要葡糖轉運體。GLUT4是脂肪細胞和骨骼肌細胞協助葡萄糖轉運的主要蛋白質。在基礎狀態下，90%位于細胞內的一些特定囊泡樣結構中，這些結構被稱作GLUT4儲存囊泡(GLUT4 storage vesicles，GSVs)。在胰島素信號或運動等的刺激下，通過激發一系列的級聯反應，細胞內的GLUT4易位到細胞外膜上，促進葡萄糖的轉運，從而使血糖降低。在胰島素含量下降時，細胞通過內吞作用將GLUT4運回細胞內，貯存于囊泡中，恢復靜息狀態。在運動或進食后，GLUT4轉運葡萄糖的效率可以比平時提高10～40倍，以滿足肌肉運動時向骨骼肌細胞快速提供能量，或餐后快速把血液中的糖轉運至細胞內[1]。許多觀察表明，GLUT4在全身葡萄糖體內平衡中起著至關重要的作用。

2 GLUT4相關信號通路

2.1PI3K/Akt途徑在胰島素信號通路中，胰島素結合其受體使胰島素受體底物(IRS)的多個酪氨酸殘基磷酸化，從而引起磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的活化。活化的PI3K產生第二信使3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，激活3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)，PDK1激活蛋白激酶B(PKB，又稱Akt)。Akt可通過提高胰島素表達、提高胰島素受體活性、強化GLUT4對胰島素的反應性、提高Akt底物蛋白160(ASl60)的表達和活性與GLUT 4構成嵌合體等機制促進GLUT4蛋白易位[2]。PI3K/Akt是調控胰島素刺激的GLUT4轉位的主要信號通路。近年來通過采用基因敲除等技術，揭示PI3K的催化亞基p85以及調節亞基p110對于調控葡萄糖代謝中的重要作用。p85調節亞基有p85α～p85β，p55γ～p55α和p50α 5種亞基，在GLUT4囊泡中只含有p85α亞基。p85α一方面通過與催化亞基 p110 結合抑制P110的活性，從而介導胰島素或其他生長因子的信號傳導，另一方面游離的p85對胰島素信號通路起負調控作用。因此，p85和p110的比例對胰島素敏感性起著重要的調控作用。當有胰島素刺激時，IRS上酪氨酸磷酸化，促使p85α解除對P110的抑制作用，P110催化膜磷脂生成PIP3，激活Akt或非典型性蛋白激酶C(aPKC)，促進GLUT4的轉位。糖原合酶激酶-3(GSK-3)是受Akt調控的重要下游分子，并且對IRS-1的活性具有抑制作用。Lochhead 等[3]研究證實，GSK-3抑制劑可以促進大鼠骨骼肌細胞內的GLUT4向細胞膜轉位，提高骨骼肌中胰島素刺激的葡萄糖轉運。這提示GSK-3是PI3K/Akt信號通路調控GLUT4的下游信號分子之一。

2.2CAP/Cbl途徑CAP/Cbl途徑是胰島素信號通路中的一個分支，由胰島素受體、原癌基因蛋白Cbl及CAP銜接蛋白等組成，是參與葡萄糖轉運的信號途徑。其中CAP是原癌基因Cbl的相關蛋白，其羧基端含有3個相毗鄰的SH3區段，Cbl通過與其中一個SH3結構域相互作用形成CAP/Cbl異源二聚體，并通過CAP與胰島素受體相連，促使Cbl的酪氨酸磷酸化。活化后的Cbl與小結合蛋白(Crk)和富含脯氨酸結構域的鳥苷交換因子(C3G)相互作用，形成CAP-Cbl-Crk-C3G的復合物。此復合體特異地與一種稱為脂筏(lipid rafts)的亞結構域發生作用，在不依賴PI3K信號通路的情況下，從而特異性地促進GLUT4的轉位。穆穎等[4]研究證實，GLUT4作為骨骼肌細胞的攝取葡萄糖的限速蛋白受Cbl、TC10的信號偶聯作用調控，而且存在時間劑量依賴關系；用β-CD封閉細胞膜上的脂筏后，cbl、TC10的信號通路也會受到抑制，GLUT4 mRNA表達豐度下降。這說明CAP/Cbl/TC10途徑也可以獨立地刺激誘導GLUT4蛋白的轉位。

2.3AMPK激活途徑AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是細胞內重要的能量代謝感受器，屬于代謝敏感性蛋白激酶家族，是調節多種代謝過程的重要信號分子。運動可以刺激骨骼肌AMPK活性的升高，并通過增加其下游級聯激活信號引起GLUT4囊泡GSVs向細胞膜的轉位。運動時，肌肉的收縮會導致骨骼肌中ATP減少、AMP增加，從而激活AMPK。在安靜狀態下，骨骼肌中AMPK可以被AICAR激活，促進葡萄糖的轉運。AICAR，全稱為5-Aminoimidazole-4-carboxamide 1-β-D-ribofuranoside，也稱AICA Riboside或Acadesine，是一種可通透細胞膜AMPK的激活劑。眾多研究發現，AICAR可以引起GLUT4表達水平的明顯增加，同時胰島素刺激后葡萄糖攝入也明顯增加[5-6]。這表明AMPK的激活是提高GLUT4表達的機制之一。有實驗研究表明，通過AICAR使PGC-1α上調會同時伴隨GLUT4的表達上調。這說明AICAR誘導GLUT4表達可能是由PGC-1介導的。同時，運動誘導的GLUT4的轉位也與AMPK有關[7-8]。然而，近來有關AMPK在葡萄糖轉運中的作用依舊備受爭議。有文獻表明，AICAR和瘦素介導的胰島素抵抗可通過AS160磷酸化和GLUT4轉運得以迅速改善，但是不是由AMPK的磷酸化引起的[9]。Viollet 等[10]的研究發現，AMPK可能在葡萄糖轉運過程中并不發揮作用。Lemieux[11]等認為，AMPK途徑并不誘導GLUT4的轉位，但是能通過刺激p38MAPKα和β誘導骨骼肌中葡萄糖的攝取。

2.4聯合作用GLUT4表達與轉位的調節與多種因素有關。目前認為，運動和胰島素濃度是調節GLUT4的兩個最重要因素。運動和胰島素都可以通過激活PI3K和MARK途徑刺激GLUT4的表達，其中胰島素對于兩條途徑的激活作用要強于運動；同時運動與胰島素對這兩條途徑的激活作用存在疊加效應。Chen[12]等發現運動可能是同時激活了aPKC和AMPK信號通路使GLUT4蛋白的表達增加。在GLUT4轉位的調節上，胰島素刺激GLUT4的轉位主要是通過胰島素信號途徑中的PI3K途徑和CAP/Cbl途徑，而運動誘導的GLUT4的轉位主要是通過AMPK、MAPK等信號實現的。林強[13]等人研究顯示，電刺激誘導的骨骼肌收縮可促進GLUT4的轉位，這一過程中AMPK和PI3K都參與了信號轉導，只抑制其中一條信號通路不能阻止GLUT4的轉位。也有研究表明，血管緊張素Ⅱ(angiotensin II, Ang II)抑制胰島素介導的GLUT4易位時至少經過了兩個途徑：一是通過抑制IRS-1/2瞬間激活ERK1/2，二是直接抑制Akt硝化。

3 氧化應激對GLUT4的表達的影響

氧化應激是指體內高活性分子，主要指活性氧自由基(ROS)和活性氮自由基(RNS)產生過多，與抗氧化防御系統作用失衡，從而導致組織損傷。ROS主要包括不帶電粒子如超氧陰離子自由基和羥自由基，以及帶電粒子如過氧化氫。ROS激活許多氧化應激有關的信號通路，作用類似于第2信使信號分子：①絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen．activated protein kinases，MAPK)信號傳導途徑；②P13K/Akt途徑；③磷脂酶C和蛋白激酶C(PKC)；④核因子(NF-κB)和共濟失調—毛細血管擴張癥突變(ATM)激酶；⑤其他的信號傳導分子和途徑：JAK/STAT途徑、C-Abl酪氨酸激酶、P66shc適配蛋白和熱休克蛋白的表達。

GLUT4的表達受多種因素的調控，其中包括胰島素濃度、運動、高脂高糖飲食等。目前認為，線粒體ROS的產生會加重骨骼肌胰島素抵抗，可能使胰島素信號通路受阻，GLUT4的表達降低，導致胰島素抵抗。研究表明，2型糖尿病大鼠骨骼肌中存在明顯的氧化應激損害，并伴隨著胰島素抵抗的明顯增加，結果顯示與GLUT4的表達降低有關。氧化應激可引起3T3-L1脂肪細胞中GLUT4表達下降，從而導致胰島素抵抗。Pessler等將3T3-L1脂肪細胞暴露于低微摩爾濃度的H2O2中, 4 h后GLUT4 mRNA 表達減少, 從氧化細胞核蛋白提取物中分析顯示結合GLUT4啟動子的胰島素反應元件減少, 表明氧化應激通過減弱核蛋白與GLUT4的啟動子的胰島素反應元件結合, 減少了GLUT4的表達，使用還原劑可以部分恢復其結合力[14]。

4 氧化應激對GLUT4的轉位的影響

有證據表明，Akt蛋白對ROS極為敏感，使PKB/Akt活性受ROS調節，自由基可以破壞其磷酸化位點影響其活化表達，而復合抗氧化劑干預既可通過全面改善機體抗氧化能力，又可以直接保護PKB/Akt免于氧化損傷，使p-Akt/Akt的表達較正常對照組顯著增加，激活下游GLUT4從細胞內向膜的轉位，促進肌肉和脂肪組織對葡萄糖的攝取。人類肥胖相關新基因LYRM1的過表達會通過抑制PI3K與Akt的磷酸化導致GLUT4轉位損傷，抑制葡萄糖的攝取，引起胰島素抵抗[15]。α-硫辛酸(α-Lipoic acid，α-LA)是一種常見的超強抗氧化劑，可以提高細胞的葡萄糖轉運能力。在過表達LYRM1基因的3T3-L1脂肪細胞中，α-硫辛酸的預處理顯著增加了胰島素誘導的GLUT4易位和葡萄糖的攝取，同時ROS水平有明顯的下降[16]。這提示氧化應激可能是通過抑制PI3K/Akt途徑引起GLUT4的轉位下調。Shibata[17]等人研究發現百草枯誘導的氧化應激抑制PI3K上P110的活性，從而削弱了3T3-L1脂肪細胞的葡萄糖攝取。這一結果顯示，PI3K上P110亞基很可能是氧化應激抑制PI3K活性以及GLUT4轉位的主要靶點。

氧化應激引起胰島素抵抗是一個較復雜的多途徑的過程，其主要環節是氧化應激產生的ROS，通過增強絲/蘇氨酸蛋白激酶等信號分子的活性，干擾GLUT4介導的葡萄糖運輸。然而，氧化應激誘導引起的胰島素抵抗究竟是由于GLUT4的轉位障礙還是GLUT4的表達不足尚不清楚。Garvey[18]等人研究發現只要存在胰島素抵抗，GLUT4的量也無減少，而轉位作用卻發生了障礙。因此，GLUT4與氧化應激之間相關性的研究對于闡明氧化應激誘導引起胰島素抵抗的機制具有重要意義。

參考文獻：

[1] Watson RT,Pessin J.Intracellular organization of insulin signaling and GLUT4 translocation[J].Recent Prog Horm Res,2005,56: 75-93.

[2] 邵磊,周書春,徐桂萍,等.體外Akt基因轉染對骨髓間充質干細胞葡萄糖轉運載體-4表達和易位的影響[J].中國普外基礎與臨床雜志,2010,17(1):52-56.

[3] Lochhead PA,Coghlan M,Rice SQ,et al.Inhibition of GSK-3 selectively reduces glucose-6-phosphatase and phosphatase and phosphoenolypyruvate carboxykinase gene expression[J].Diabetes,2001,50(5):937-946.

[4] 穆穎,季愛玲,劉寒強,等.原代培養骨骼肌細胞胰島素抵抗模型的建立[J].現代生物醫學進展,2008, 8(3):433-436,封2.

[5] Jessen N, Pold R, Buhl ES, et al. Effects of AICAR and exercise on insulin-stimulated glucose uptake,signaling,and GLUT-4 content in rat muscles[J].Journal of Applied Physiology,2003,94(4):1373-1379.

[6] Jorgensen SB,Viollet B,Andreelli F,et al.Knockout of the alpha2 but not alpha1 5’-AMP-activated protein kinase isoform abolishes 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-4-ribofuranosidebut not contraction-induced glucose uptake in skeletal muscle [J]. The Journal of biological chemistry,2004,279(2):1070-1079.

[7] Stephens BR,Sautter JM,Holtz KA,et al.Effect of timing of energy and carbohydrate replacement on post-exercise insulin action[J].Appl Physiol Nutr Metab,2007,32(6):1139-1147.

[8] Arias EB,Kim J,Funai K,et al.Prior exercise increases phosphorylation of Akt substrate of 160 kDa (AS160) in rat skeletal muscle[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2007, 292(4):1191-1200.

[9] Alkhateeb H,Chabowski A,Glatz JF,et al.Restoring AS160 phosphorylation rescues skeletal muscle insulin resistance and fatty acid oxidation while not reducing intramuscular lipids[J].American Physiological Society,2009,297(5):1056-1066.

[10] Viollet B,Andreelli F,Jorgensen SB,et a1.The AMP-activated protein kinase alpha2 catalytic subunit controls whole-body insulin sensitivity[J].The Journal of clinical investigation,2003,111(1):91-98.

[11] Lemieux K, Konrad D, Klip A,et al.The AMP-activated protein kinase activator AICAR does not induce GLUT4 translocation to transverse tubules but stimulates glucose uptake and p38 mitogen-activated protein kinases alpha and beta in skeletal muscle[J].FASEB journal,2003,17(12):1658-1665.

[12] Chen HC,Bandyopadhyay G,Sajan MP,et al.Activation of the ERK pathway and atypical protein kinase C isoforms in exercise-and aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-D-riboside (AICAR)-stimulated glucose transport[J].The Journal of biological chemistry,2002, 277(26):23554-23562.

[13] 林強,吳毅,胡永善,等.電刺激對2型糖尿病大鼠骨骼肌細胞葡萄糖運載體4轉位及相關信號蛋白的影響[J].中華物理醫學與康復雜志, 2008, 30(7): 443-447.

[14] Pessler D, Rudich A, Bashan N. Oxidative stress impairs nuclear proteins binding to the insulin responsive element in the GLUT4 promoter[J] . Diabetologia, 2001, 44(12): 2156-2164.

[15] Kou C,Cao X,Qin D,et al.Over-expression of LYRM1 inhibits glucose transport in rat skeletal muscles via attenuated phosphorylation of PI3K (p85) and Akt.[J].Molecular and Cellular Biochemistry,2011,348(1/2):149-154.

[16] Qin ZY, Zhang M,Guo XR,et al.α-Lipoic acid ameliorates impaired glucose uptake in LYRM1 overexpressing 3T3-L1 adipocytes through the IRS-1/Akt signaling pathway[J].Journal of bioenergetics and biomembranes, 2012,44(5):579-586.

[17] Shibata,Michihiro,Hakuno,et al.Paraquat-induced Oxidative Stress Represses Phosphatidylinositol 3-Kinase Activities Leading to Impaired Glucose Uptake in 3T3-L1 Adipocytes[J].The Journal of biological chemistry, 2011,285(27):20915-20925.

[18] Garvey WT,Maianu L,Zhu JH,et a1.Evidence for defects in the trafficking and translocation of GLUT4 glucose transporters in skeletal muscle as a cause of human insulin resistance[J].The Journal of clinical investigation,1998, 101(11):2377-2386.