艾灸刺激穴位局部感受的生物學基礎

余曙光 唐 勇 尹海燕 吳巧鳳 羅 玲 張承舜 王家平 趙 利 魯 娟 左 甲 范亞朋 周新異

(成都中醫藥大學，成都，610075)

中醫學認為，穴位是臟腑、經絡之氣輸注于體表的特定部位，既是臟腑疾病在體表的反應點，又是針灸疏通氣血、調整臟腑功能的激發點。因此，穴位在艾灸中的作用至關重要。已有的研究成果認為，艾灸的主要作用機理是由艾葉燃燒時所產生的物理因子和化學因子作用于腧穴感受裝置與外周神經傳入途徑，刺激信號傳入中樞，經過整合作用傳出信號，調控機體神經－內分泌－免疫網絡系統、循環系統等，從而調整機體內環境，以達到防治疾病的目的［1－2］。從這一復雜的作用程序來看，穴位既是艾灸取得臨床療效的關鍵環節，也是艾灸作用的始動環節。而始動環節往往對后期環節的發生與發展起到決定性作用。因此，從穴位局部的源頭去探尋艾灸的作用機理，可能是艾灸作用機理研究的重要突破口。那么，穴位接受艾灸刺激后會有什么樣的反應?其反應特征如何?目前，尚未有清晰的回答。我們在973計劃課題的資助下，重點從穴位局部溫度、血流、分子事件、免疫、瞬時感受器電位(Transiennt Receptor Potential，TRP)通道、嘌呤信號等環節進行初步詮釋艾灸穴位局部感受的生物學基礎。

1 艾灸刺激后穴位局部溫度的變化

艾灸療法主要是通過燃燒艾絨產生溫熱，刺激人體體表穴位局部來達到治病保健的目的。傳統的艾灸治療方法非常豐富，不僅有溫和灸方法，還有隔姜灸、隔附子餅灸等多種隔物灸方法。無論哪種艾灸治療方法，其最基本的刺激均為溫熱刺激。而艾絨燃燒時的局部溫熱效應是艾灸產生療效的重要因素。艾絨燃燒時產生的溫度刺激是艾灸局部溫熱效應的重要體現。施灸穴位局部的皮膚是感受艾灸溫熱刺激的第一線。現已研究發現，在艾灸的操作過程中，溫度處于不斷的升降變化之中，而且不同艾灸方法具有穴位局部不同特征的溫度曲線［3］。但是目前結合人體試驗觀察常用艾灸方法的溫度曲線特征相對較少。

為此，我們通過招募志愿者，運用熱電偶測溫儀實時動態監測健康人足三里接受溫和灸、隔附子餅灸和隔姜灸三種不同灸法刺激后穴局部的溫度曲線研究發現:溫和灸施灸后快速升溫，溫度遞增的幅度較小，呈小幅度的波動，撤灸后，溫度先迅速下降5～6℃后便進入緩慢下降期，到約25 min時溫度回到艾灸前水平;隔物灸施灸后隨著壯數的增加溫度不斷升高，后一壯較前一壯的溫度遞增幅度較大，且呈現出梯度上升的特點，即后一壯的波谷較前一壯有上抬趨勢，后一壯波峰高于前一壯的現象;隔物灸在撤灸后，溫度有小幅度的回抬，隨后迅速下降回到艾灸前水平。另外，在最高溫度方面，我們發現:溫和灸皮膚最高溫度為(46.28±2.12)℃，皮膚不起泡;隔附子餅灸皮膚最高溫度為(48.96±3.26)℃，部分受試者穴位會起灸泡;隔姜灸皮膚最高溫度為(52.62±4.46)℃，灸后均有灸泡產生，程度較隔附子餅灸明顯。3種灸法的最高溫度表現為:隔姜灸＞隔附子餅灸＞溫和灸。

2 艾灸刺激后穴位局部血流的改變

目前研究證實艾灸改善微循環療效確切，艾灸療效的發揮是由艾灸的藥物成分，燃燒過程中產生的溫熱刺激和紅外輻射共同作用的結果，能啟動血管的自律運動，改善局部微循環，這也可能是艾灸活血化瘀作用的途徑之一。另外，艾灸可以改善患者甲皺微循環的血流速度、血流形態、血管管徑等指標［4－6］;艾灸可以引起手部微循環血流量的增加［7］。對血瘀證的研究也發現［8］，艾灸能降低血瘀證大鼠血漿和全血黏度。

但是艾灸后穴位局部血流改變如何?我們采用運用激光多普勒血流儀監測健康受試者足三里穴艾灸前后血流灌注量。結果表明:溫和灸組、隔附子餅灸組、隔姜灸組艾灸前血流灌注量比較，3組間血流灌注量無差異(P＞0.05);艾灸后，3組間血流灌注有差異(P＜0.05)，隔姜灸＞隔附子餅灸＞溫和灸。

3 艾灸刺激后穴位局部的全局分子事件

艾灸刺激后穴位局部溫度升高、血流加速，是否會進一步引起穴位局部不同的基因表達變化?為全面篩選穴位局部接受艾灸刺激后的差異基因，我們選擇全基因表達譜芯片和生物信息學技術相結合，以“足三里”為代表，探索“足三里”穴位局部在不同狀態下(生理、病理)接受艾灸刺激后基因表達譜的響應及其響應特征。結果發現:生理狀態下，艾灸后“足三里”穴位局部的差異表達基因217個，其中上調基因145個，下調基因72個;病理狀態下，艾灸后“足三里”穴位局部的差異表達基因498個，其中上調基因255個，下調基因243個;生理、病理狀態下，“足三里”穴位局部對艾灸刺激響應的共表達差異基因27個。另外也發現，不同機體狀態，穴位局部對艾灸刺激應答的差異基因表達譜特征不同:生理狀態下，“足三里”穴位局部對艾灸刺激應答基因可能主要富集于代謝相關的信號通路，參與代謝相關生物過程;病理狀態下，“足三里”穴位局部對艾灸刺激應答基因可能主要富集于免疫相關信號通路，啟動機體的免疫應答生物過程。其中Hspa1a、Ank1、Ccnb1、Stmn1、Nedd4、Ube2c、Lgmn、Parvb、Areg、Ccna2、Ccnb2、Cpa3、Mad2l可能是病理狀態下穴位局部對艾灸刺激應答中起關鍵調控作用的節點。這些差異基因或共表達差異基因、關鍵調控節點都將是下一步深入探索艾灸穴位局部分子機制新的靶點。

4 艾灸刺激后穴位局部免疫變化

目前針灸研究者基本達成共識:針灸對神經內分泌網絡具有良好的調整作用，這是針灸對機體免疫調節的重要途徑。但是，隨著免疫學研究成果和研究思路的不斷深入，目前越來越多的研究表明，皮膚不僅是一種物理屏障，能阻止外界物質機械侵入和防止體內水分、營養物質等丟失，它還是一種免疫系統。在皮膚免疫系統中，其細胞成分包括郎罕細胞，T、B細胞，角質形成細胞，內皮細胞，巨噬細胞;分子成分則包括各種細胞因子、神經肽、各種免疫蛋白等，這些細胞成分和分子成分在皮膚局部構成了特有的免疫系統，并和神經內分泌免疫網絡一起，形成皮膚—神經內分泌免疫網絡系統(NICS)，介導免疫應答及其調節［9－12］。

我們分別以衰老模型和佐劑性關節炎模型為研究對象，結果發現，艾灸后施灸部位皮膚MHC－II、IL－12、CD80、波形蛋白或瘦素、瘦素受體等與皮膚免疫密切相關的蛋白表達陽性細胞數均顯著多于模型組(P＜0.01)。由此可能啟示:艾灸對免疫低下和免疫紊亂的調節，施術局部皮膚免疫功能的激活也可能是其重要的一個途徑。這樣，與以前的神經免疫網絡調節相互結合，可能形成艾灸－皮膚－神經免疫網絡調節系統，以更全面地闡釋艾灸的免疫調節作用基礎。也許還是其他施術于穴位局部的針灸特色療法(如滾針、皮膚針、拔罐、推拿等)實現機體免疫調節的始動環節。

5 艾灸刺激后穴位局部瞬時感受器電位(TRP)通道的激活

近年研究發現，TRP通道是軀體感覺系統感受溫度刺激的重要初級分子換能器［13］。TRP家族成員很多，包含 7個亞家族，即由 TRPV、TRPC、TRPM、TRPML、TRPP、TRPA、TRPN 等家族組成;分布也較廣泛，除中樞神經系統外，還分布于外周神經系統、皮膚、心血管系統，以及免疫和內分泌系統等。TRPV1主要表達于Aδ纖維和C類纖維，以及角質細胞、肥大細胞、脂肪細胞、朗格罕細胞及平滑肌細胞;TRPV2主要表達于背根神經節(DRG)、Aβ纖維和Aδ纖維，也表達于角質細胞和肥大細胞;TRPV3和TRPV4都不僅表達于角質細胞，而且也表達于感覺神經元［14－18］。

不同的TRP通道感受溫度閾值不一，其中TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4 與溫熱刺激相關，而 TRPM8、ANKM1主要感受冷刺激;與溫熱刺激有關的溫度閾值分別為:TRPV1:＞42°C，TRPV2:＞52°C，TRPV3:32 –39°C，TRPV4:27 –34°C;TRPV1、TRPV2 感受的溫熱刺激主要是損傷性熱刺激;TRPV3、TRPV4感受的溫熱刺激主要是非損傷性熱刺激［19－23］。我們通過點制TRP功能基因芯片分類及結合熒光定量PCR分析發現:Trp家族的響應是，生理、病理狀態下均有應答，且不同艾灸刺激響應各異。生理狀態下，溫和灸引起Trpv3上調，Mcoln1、Trpc1下調;隔附子餅灸 Trpv2上調，Trpc1下調。在病理狀態下，溫和灸組引起Trpv3上調，Trpc1下調;隔附子餅灸Trpv2上調，Mcoln1下調。本次研究暫未發現Trpv1和Trpv4的響應變化。具體原因我們正在進一步深入分析。

6 艾灸刺激后穴位局部嘌呤信號的變化

嘌呤信號包括嘌呤類物質及其受體。嘌呤類物質包括三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate，ATP)及其代謝產物二磷酸腺苷(Adenosine Diphosphate，ADP)、一磷酸腺苷(Adenosine Monopho sphate，AMP)和腺苷(A-denosine，ADO)，均屬于神經遞質，具有傳遞信息的作用。嘌呤受體包括P1(腺苷)和P2(腺嘌呤核苷酸)受體兩大類。P1受體已全部被克隆，分為A1、A2和A3種類型，其中 A2受體又分為 A2a和 A2b兩種亞型［24］;P2受體又分為P2X和P2Y受體，迄今已有7型P2X受體(P2X1－7)、9型 G蛋白偶聯的 P2Y受體(P2Y1，P2Y2，P2Y4，P2Y6，P2Y11，P2Y12，P2Y13，P2Y14)被克隆［25］。P1受體主要對ADO和AMP反應性強，P2嘌呤類受體對ATP和ADP反應性強［24－26］。

2010年5月，Nature Neuroscience發表美國羅徹斯特大學Maiken Nedergraard教授課題組針刺鎮痛通過穴位局部嘌呤信號腺苷及A1受體介導的研究成果［27］，并于2011年12月在Journal of Pain發表研究文章表明:給予健康人針刺足三里后穴位局部腺苷水平升高［28］，進一步證實了動物實驗結果，為穴位局部腺苷介導針刺鎮痛提供了證據;2011年，英國Geoffrey Burnstock教授在《The Scientist》撰文指出嘌呤信號參與針灸工作原理輪廓:1)針灸針通過提插捻轉機械刺激引起皮膚變形，導致皮膚角質細胞釋放ATP;2)激活位于皮膚感覺神經末梢的ATP的特定受體(如P2X3、P2X2/3受體);3)信號通過背根神經節到達脊髓，然后通過中間神經元途徑到達腦干、在大腦皮層的痛覺區，傳遞信息抑制疼痛［29］。基于“針所不為、灸之所宜”的指導，我們提出假說認為，可能艾灸和針刺穴位局部的嘌呤信號感受存在差異。通過初步研究發現，艾灸“足三里”對完全弗氏佐劑(CFA)造模誘導的小鼠炎癥疼痛，具有顯著的鎮痛效應;同時，CFA誘導的疼痛模型小鼠接受艾灸刺激后“足三里”穴位局部ATP含量升高;在“足三里”給予ATP促分解劑后，鎮痛效應降低;但給予ATP分解抑制劑后，艾灸鎮痛效應增強。初步顯示穴位局部ATP與艾灸鎮痛效應相關，這和針刺后“足三里”穴位局部腺苷含量升高截然不同，有待深入研究。

7 未來的工作

穴位局部在艾灸防治疾病中究竟處于什么樣的地位和角色，目前的研究尚不夠深入、全面。今后需要回答的問題包括:1)穴位局部感受的艾灸刺激成分是什么?整個艾灸治療過程，涉及到可能對穴位局部產生的成分應包括:熱(艾灸后的產熱)、光(艾灸燃燒過程中的紅外光輻射)、藥(艾或者其他藥物成分)、煙(艾灸燃燒后的艾煙成分，如焦油等)、味(艾灸過程的氣味)等。目前研究較多的為熱和光，其他刺激成分作用如何?不同刺激成分的穿透深度怎樣?所有刺激成分相加的疊加效應如何?即使是溫熱刺激，也應進一步明確艾灸刺激的損傷性和非損傷熱刺激分別等等。2)穴位局部感受的生理結構是什么?角質細胞、肥大細胞、梅克爾細胞(Merkel's cell)抑或其他?不同刺激成分相應的是什么結構接受感受?3)穴位局部感受后的生物學機制是什么?穴位局部接受不同刺激成分感受后，其治療效應(局部治療效應、整體治療效應或內臟、遠端調節等)是否有不同的感受后生物學機制參與?

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