牛支原體病診斷方法的研究進展

蔣 勇，周 蓓，黎曉敏

（西南大學動物科技學院，重慶 400715）

牛支原體（Mb）是一類沒有細胞壁、介于細菌和病毒之間、能進行自我復制、獨立生活的簡單和極微小的原核微生物，是引起牛肺炎、關節炎、乳房炎、流產與不孕等多種疾病的主要病原之一。牛支原體菌是在1961年首次從美國患乳腺炎病牛中分離獲得，而我國2008年首次從患肺炎的犢牛肺臟中分離到牛支原體，此后開始在我國蔓延[1-2]。由于牛感染牛支原體后的臨床癥狀和病理剖檢變化與傳染性胸膜肺炎非常相似，因而，實驗室檢測對于該病的準確診斷具有重大意義。并且牛支原體繼發或混合感染其他病原體時，臨床癥狀加重，甚至死亡率增加。因此，有效預防控制和準確診斷對于我國牛養殖業至關重要。

1 臨床診斷

感染牛支原體病的牛出現體溫升高、慢性咳嗽、氣喘、伴有清亮或膿性鼻汁。嚴重者食欲減退，被毛粗亂無光，生長受阻，并出現糞水樣或帶血糞便。有的患牛繼發乳腺炎、關節炎、結膜炎，甚至出現流產和不孕。該病發病率高，治療不當或不治情況下死亡率增高，與其他細菌或病毒混合感染時造成牛支原體病臨床癥狀復雜化，而且有些感染牛出現隱性感染，不表現出臨床癥狀[2]。因此，通過臨床癥狀只能懷疑感染牛支原體病而不能作出準確判定。

2 病理學診斷

剖檢病理變化主要在肺臟和胸腔。有些病牛伴有不同程度的肺和胸膜黏連，并有少量積液。輕者可見肺尖葉、心葉及部分膈葉有局部紅色肉變，而且有些會出現化膿。嚴重者肺部多部位出現壞死灶，切開為干酪樣。

3 病原體檢測技術

3.1 病原分離培養

通過改進分離培養基分離方法，按照實驗室規范操作接種病料于培養基上，5%CO2培養箱中培養3～4 d，牛支原體在固體培養基上具有典型的“煎蛋樣”圓形菌落特征，邊緣整齊，表面光滑，中間厚周邊薄，可見菌膜斑點；加入酚紅液體培養基中顏色由紅變黃，而且液體透亮。此分離方法從病變部位分離牛支原體分離率增高，但由于牛支原體分離培養難度大、穩定性差、培養時間長、靈敏度低，還不能作為牛支原體感染快速診斷的方法。

3.2 免疫酶技術

酶聯免疫過氧化物（ELIP）和間接免疫過氧化物酶試驗用于檢測病肺中的牛支原體，克服了熒光抗體技術檢測慢性感染牛不敏感、需要新鮮樣本和熒光顯微鏡以及樣品不能長期保存的缺點。用免疫酶技術檢查肺切片和涂片時，支原體被染成淡紅褐色的多形態顆粒，反應很穩定。目前該方法在檢測豬、羊等支原體肺炎病時較常用，而用于牛支原體檢測只見有少量相關報道。

3.3 免疫組化技術

免疫組化是一種特異性強、敏感度高的病原鑒定方法。該方法可以檢測到牛支原體抗原在機體的分布狀態，分離培養表明，牛支原體存在但病原培養又為陰性時，免疫組化技術就可以輔助分離培養定性鑒定牛支原體的存在。在干酪樣壞死性支氣管肺炎中，免疫組化顯示牛支原體抗原廣泛分布于壞死灶周圍；抗原主要存在于巨噬細胞的胞漿內，同時也存在于肺泡和支氣管腔內的各種白細胞以及淋巴細胞內。雖然免疫組化法特異性強，敏感度高，但只能針對局部小塊病變組織，如果病灶選擇偏差或病情輕微時，免疫組化將很難檢測到病原體。

4 免疫印跡法

免疫印跡是以免疫覆蓋液為檢測探針，對抗原或抗體進行印跡分析的通稱。蛋白質印跡中由于引進了血清學檢測技術，使結果的分析更加準確、細致。Thomas等通過對分離菌株表面膜蛋白分析，發現所有分離菌株Vsp蛋白表達具有高度的差異性[3]。Ghadersohi等通過將無乳支原體、牛生殖道支原體、精氨酸支原體以及牛支原體全細胞膜蛋白轉移到硝酸纖維素膜進行免疫印跡分析，發現牛支原體具有獨一無二的單克隆E4蛋白[4]。

5 核酸診斷技術

從牛支原體DNA中準備一個SauⅢA消化的基因組庫，克隆到pUC19，再用準備好的純化牛支原體DNA探針克隆雜交確定雜交的程度[6]。牛支原體的DNA片段就從EcoRⅠ和HindⅢ消化的重組質粒中重新取回。而這種從牛支原體、無乳支原體、牛生殖道支原體、羊肺炎支原體以及不同種屬的精氨酸支原體中取出的固定化DNA可以隨意用來進行引物探針斑點雜交分析。除牛支原體和羊肺炎支原體DNA外，其他都被發現有雜交跡象。此方法敏感性高、特異性強，但需進一步結合PCR作出準確的結果判定。

6 PCR診斷技術

多聚酶鏈式反應（PCR）診斷鑒定方法可縮短牛支原體的鑒定時間，解決牛支原體培養和鑒定難、費時的難題，使牛支原體在實驗室診斷鑒定中顯得更加準確、方便、快捷。近年來，國內外對牛支原體PCR診斷鑒定研究眾多，除普通PCR外，套式PCR、多重PCR、巢式PCR、RT-PCR等鑒別技術也是PCR診斷技術的研究重點。

基于牛支原體和牛無乳支原體16S rRNA同源性高的特點，Subramaniam等、Bashiruddin等分別使用UvrC基因特異序列和牛支原體oppD/F基因進行PCR擴增[5-6]。而李媛等基于oppD/F基因序列對引物進行改良，建立了牛支原體套式PCR檢測技術，提高了PCR方法敏感性，避免了非特異性的產生[7]。李大偉等根據牛支原體、絲狀支原體絲狀亞種小克隆和無乳支原體3種病原的基因組序列保守區域設計3對特異性引物建立三重PCR方法，與牛支原體分離培養檢測結果一致，但敏感性低于單一PCR[8]。Foddai等基于牛支原體p81基因序列設計建立了多重PCR和PCR-RFLP診斷技術，成功鑒別牛支原體和無乳支原體，而且特異性更強，靈敏度更高[9]。此外，Pinnow等建立了特異的巢式PCR鑒定方法，該方法可以鑒定用防腐劑處理過的牛奶樣品[10]。Thomas等通過對20株牛支原體uvrC基因測序，并利用PCR擴增到92株，證明了uvrC基因是PCR診斷牛支原體的保守序列[11]。

7 血清學抗體檢測技術

目前可用于牛支原體的血清學試驗有血球吸附試驗、放射免疫擴散測定、沉淀反應試驗、熒光抗體技術試驗、補體結合試驗、間接血凝試驗、凝集試驗以及酶聯免疫吸附試驗等，其中用全細胞或抗原處理的間接酶聯免疫吸附試驗（ELI?SA）是現在最為有效的檢測方法。

ELISA主要用于牛支原體感染的血清學流行病評估及其暴發流行檢測，同時也用于檢查牛群感染狀態的檢測。在歐洲以及北美已普遍用于牛奶中抗M.bovis抗體診斷檢測，這使得檢測M.bovis的感染部位成為可能，其有效性和敏感性比傳統鑒定方法有所提高。Byrne等采用間接ELISA對奶牛場乳腺炎牛支原體感染及牛支原體組織樣品濾過液進行病原學調查[12]。制備牛支原體特異性單克隆抗體，并建立一個夾心ELISA方法來檢測培養基中是否有牛支原體抗原存在，目前已經成為商品化診斷產品。此外，其他ELISA方法也可以用于建立識別抗M.bovis特異蛋白抗體，如利用重組Vsp蛋白或無乳支原體P48蛋白的同源物——膜脂蛋白作為目標抗原[12]。有研究表明，P48蛋白抗血清能識別所有待檢的牛支原體，同時不與牛群中其他的同型支原體交叉反應，說明應用P48蛋白建立的ELISA實驗能用于M.bovis感染的一種特異性標記。并且利用VspA重組蛋白作為包被抗原建立ELISA的檢測方法可檢出自然感染和試驗感染動物血清中的特異抗體。目前，比利時、美國、加拿大、瑞士等國已經成功生產出商品化的牛支原體血清抗體檢測試劑盒。而在我國，由于牛支原體研究起步晚，市場上雖有商品化的牛支原體血清抗體檢測試劑盒，但是檢測靈敏度以及精確性有待進一步提高。

8 結語

我國是傳統養殖大國，牛、羊養殖對畜牧業發展起著重要作用，牛支原體病嚴重威脅著我國養牛業健康快速發展。探索高效、快速、特異的檢測手段對于牛支原體疾病的診斷和治療具有十分重要的意義。近年來，牛支原體病引起我國學者廣泛關注與重視，然而，現階段我國對于牛支原體的研究尚處于起步階段，因此需要深入研究牛支原體的免疫機制、流行病學、致病機理，開發有效疫苗和疾病診斷試劑盒，有效防控牛支原體病，保障養牛業的健康快速發展。

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