6味中草藥及配伍方劑提取物對3株大腸桿菌的體外抑菌試驗

王瑩瑩，付小寶，于 聰，李 冰，王雪瑩，郝景鋒

（吉林農業科技學院動物醫學學院，吉林 吉林 132101）

隨著在防疫與治療上對抗生素的依賴性逐漸增大，耐藥性、藥物殘留等問題接踵而至，大腸桿菌又屬于多血清型和變異性強的細菌，極易產生耐藥性[1-2]。中草藥以其抗菌消炎、不易產生耐藥性、無毒（低毒）、無殘留（低殘留）等特點脫穎而出[3]。試驗選用6味中草藥及其配伍方劑提取物對3株大腸桿菌進行了體外抑菌實驗，以期為臨床治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗菌株：大腸桿菌1（O111∶K58）、大腸桿菌2（O128∶K67）、大腸桿菌3（O44∶K74），來自吉林農業大學預防獸醫學微生物實驗室。培養基：普通肉湯培養基、普通瓊脂培養基、ss瓊脂培養基、牛肉膏蛋白胨培養基、伊紅美蘭瓊脂培養基、改良馬丁肉湯培養基（加微量酚紅）。單味藥物：板藍根、黃連、魚腥草、金銀花、蒲公英、大青葉。配伍方劑：方劑一由黃連、魚腥草、蒲公英組成；方劑二由板藍根、黃連、魚腥草、金銀花、蒲公英、大青葉組成；方劑三由金銀花、板藍根、魚腥草、黃連、大青葉組成。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥液制備

每味中草藥均按照水提法進行煎煮，加熱至沸后改用文火保持30 min，用紗布過濾，重復2 次，合并3次濾液，濃縮至含生藥1g·mL-1，1000 rpm離心15 min，取上清液置于試管中備用，按照配伍方劑要求，分別取等量藥液，配出3個配伍方劑，置于試管中，調pH 至7.4～7.6，100℃滅菌10 min后，4℃保存備用[4]。

1.2.2 培養基制備

普通肉湯培養基、普通瓊脂培養基、ss瓊脂培養基、牛肉膏蛋白胨培養基、伊紅美蘭瓊脂培養基、改良馬丁肉湯培養基（加入微量酚紅），均按照常規方法配制，調pH至7.2～7.6，高壓滅菌，制成平板培養基（除肉湯培養基外），冷卻后置于無菌室備用。

1.2.3 菌液制備

從分離菌株試管的斜面上挑取2～3接種環的細菌分別接種于SS 瓊脂培養基、牛肉膏蛋白胨培養基、伊紅美蘭瓊脂培養基上，37℃培養12～18 h后，觀察大腸桿菌的生長情況，從牛肉膏蛋白胨培養基上挑取乳白色的單個菌落，接種于5 mL 普通營養肉湯中，37℃培養24～36 h，取0.5 mL 于普通瓊脂平板上培養8～12 h，用滅菌生理鹽水洗下菌落并稀釋，后用平皿傾注法估測活菌數后稀釋至1.0×109cfu·mL-1，即為試驗菌液。

1.2.4 最小抑菌濃度

采用試管二倍稀釋法，向滅菌試管中加入改良馬丁肉湯培養基1 mL，依次編號，在第1管內加入藥液1 mL，混勻后吸取1 mL，至第2管，依次類推至第9管棄去1 mL，然后于每管中加入改良的馬丁肉湯培養基0.1 mL作103稀釋（約含1.0×105cfu·mL-1）的菌液，第10 管作為陽性對照，第11 管作為陰性對照。第1管至第9管藥物濃度分別為1000、500、250、125、62.5、31.3、15.7、7.8、3.9 mg·mL-1，37℃培養18～24 h，觀察結果。以培養物透明、不顯紅色的藥物濃度為該藥物的最小抑菌濃度（MIC）。從該試管中取培養物0.01 mL 接種到普通瓊脂平板上，37℃培養24～48 h，以菌落數＜3個視為無細菌生長，以無細菌生長的藥物最低濃度作為該藥的最小殺菌濃度（MBC）。重復試驗3次，取平均值。

2 試驗結果

6 味中草藥及其配伍方劑對3 種血清型大腸桿菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度見附表。

附表 6味中草藥及配伍方劑對3種大腸桿菌的MIC和MBC mg

由附表可以看出，單味黃連和方劑三的MIC值最小，表明黃連和方劑三對所選用的大腸桿菌1（O111∶K58）、大腸桿菌2（O128∶K67）和大腸桿菌3（O44∶K74）抑菌效果較明顯。

3 討 論

3.1 發病原因

大腸桿菌病主要發生于密集化養禽場，各種禽類不分品種性別、日齡均對本菌易感。幼齡禽類發病最多，污穢、擁擠、潮濕、通風不良的環境，過冷過熱或溫差很大的氣候，有毒有害氣體（氨氣或硫化氫等）長期存在，飼養管理失調，營養不良（特別是維生素的缺乏）以及病原微生物（如支原體及病毒）感染所造成的應激等均可導致本病的發生[5-6]。

3.2 耐藥性分析

大腸桿菌病已經成為威脅畜禽業發展的主要細菌性疾病之一。大腸桿菌的血清型較多，具有地域差異性，在防治上多采用抗生素治療，但由于其極易產生耐藥性和藥物殘留等現象，因此急需另一種治療方式進行優化，而中草藥治療以其抗菌、消炎、不易產生耐藥性的特點脫穎而出。劉麗艷以白頭翁、黃連、板蘭根、大青葉、甘草等藥物為主組成的中草藥組方按0.5%～1%比例拌料或加入飲水中，結果表明，在感染的不同時期，用中草藥防治大腸桿菌病，預防組保護率在94%，比對照組高14%；治療組在感染的不同時期用藥，其最高保護率有很大差異，平均保護率達90.67%，比對照組高8.67%；對蛋種雞的預防性試驗表明，發病率與病死率均較低，分別為1.8%、11.1%，比對照組低2.7%、13.3%；治療組最高保護率達90%，比對照組高7%。有效率達100%，比對照組高10%，對三黃肉雞治愈率達94%，比對照組高8%[7]。潘樹橋等針對性地選取對本地區大腸埃希氏菌有抑菌作用的中藥組成黃芩散經對人工感染雞和現地應用，結果表明，用于防治肉用仔豬大腸桿菌病具有良好的效果，總保護率達93.0%[8]。

3.3 藥敏試驗分析

在特定環境下孵育24 h，可抑制某種微生物出現明顯增長的最低藥物濃度即最小抑菌濃度，用于定量測定體外抗菌活性[9]。李淑梅等選用黃連、黃芩、梔子、石榴皮、大黃5味中草藥，采用煎煮法提取有效成分，并對這5味中藥提取物在體外對致病性大腸桿菌的抑菌效果進行了測定，試驗結果表明，不同中藥提取物在不同濃度時對大腸桿菌有不同的抑制作用，黃連、黃芩對試驗菌株的抑菌作用最強，而其他3 味藥物在高濃度時有效，低濃度時無效；黃連、黃芩、大黃3味藥物組合能增加抑菌效果，黃連、黃芩和梔子組合也能加強抑菌效果，而在配方中加入石榴皮的抑菌效果增加不顯著（P＜0.05）[10]。劉玉慶等用平板法、管碟稀釋法檢測大腸桿菌、沙門氏桿菌、芽胞桿菌對23種單味中藥、復方清熱解毒類中藥的敏感性，試驗結果表明，黃芩、秦皮、黃連、大黃、連翹、金銀花、夏枯草、石榴皮等具有清熱解毒、瀉火燥濕功用的藥物抑菌效果較好，以三黃湯為基礎方的清熱解毒類復方中草藥抑菌作用好，對大腸桿菌的MIC為125～500 mg·mL-1，復方中草藥比單味MIC高[11]。

本試驗利用二倍稀釋法測定各血清型大腸桿菌的最小抑菌濃度，通過在培養基中加入指示劑而鑒定抑菌情況。若培養基不變紅色時，說明無細菌生長或僅有少量細菌生長，這樣便可以更直觀的判斷結果。由于每種中草藥及各配伍方劑的藥性與抑菌作用各不相同，因此對3株大腸桿菌的抑菌程度不同，因此各自的最小抑菌濃度也各有區別。由于黃連對該菌的抑制作用較強，因此黃連的MIC最小，而方劑三的MIC次之。單味中藥抑菌作用較好，但方劑也有其優勢。方劑不僅可以抑菌，同時還有調理動物機體的作用，從而增強其抵抗力。試驗結果表明，單味中草藥黃連以及由金銀花、板藍根、魚腥草、黃連、大青葉組成的方劑三對大腸桿菌具有良好的抑菌作用。

4 結 論

試驗結果表明，單味中草藥黃連以及由金銀花、板藍根、魚腥草、黃連、大青葉組成的組方對大腸桿菌具有良好的抑菌作用。

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[10]李淑梅,楊帆.中草藥提取物對大腸桿菌的體外抑菌試驗[J].安徽農業科學,2006,34（23）:6212-6222.

[11]劉玉慶,車程川,張玉忠,等.大腸桿菌對中草藥敏感性試驗及其方法研究[J].中獸醫醫藥雜志,2003（1）:3-5.