溫度及pH對胞外乳糖酶酶學性質的影響

秦 操

（河南省新鄉市紅旗區職業高中，河南 新鄉 453003）

乳糖酶被國際酶學委員會命名為β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，簡稱為β-半乳糖苷酶，其能催化乳糖水解生成等摩爾量的葡萄糖和半乳糖[1-4]。

牛乳是營養豐富的天然食品，其中乳糖含量約為4.7%～5.0%，是乳中最重要的碳水化合物。對于體內缺乏乳糖酶的人群，乳糖在小腸中不分解而直接進入大腸，被大腸中的細菌酵解產生多種氣體及短鏈脂肪酸，會導致腹脹、排氣增多、腹痛和腹瀉等不良病癥，被稱為乳糖不耐癥[5]。利用乳糖酶水解乳中的乳糖是解決乳糖不耐癥的最佳途徑，乳糖酶在低乳糖乳及乳制品中的應用對于乳品加工具有重要意義。

微生物來源乳糖酶的研究日益受到人們的重視，特別是絲狀真菌產生的乳糖酶因其適宜的pH、良好的穩定性、細胞外分泌和表達量較高的特點而成為研究的熱點[6-8]。目前，黑曲霉、米曲霉、青霉、毛霉等的乳糖酶已經被分離純化[9-12]。本研究所選用的是由亮色毛霉經固態發酵所獲的胞外高溫乳糖酶，此酶作用溫度較高，反應速度快，可以有效地減少雜菌污染，且提取時不需要破壁處理。為了使此高溫乳糖酶能夠真正用于工業化生產，本試驗對其產生的高溫乳糖酶的最適溫度、熱穩定性、pH等酶學性質進行了研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

發酵原料：麩皮；發酵菌種：亮色毛酶，購自中國獸醫藥品檢察所；其他培養基材料：酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉、葡萄糖等；檢測試劑盒：ONPG檢測試劑盒，購自上海生工生物工程公司。

1.2 試驗設備

J-25型高速冷凍離心機、DL201型恒溫自動干燥箱、BS-2F 恒溫振蕩培養箱、磁力攪拌器、JA2003電子天平、DZKW-C型水浴鍋、HZQ-F160高壓蒸汽滅菌鍋、Delta 320 pH計。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳糖酶固態發酵

將麩皮和蒸餾水按比例1∶1.5混合放入250 mL三角瓶中，裝量控制在1/3。其中固體物質定量為10 g，攪拌均勻，作為基礎培養基。外加碳源-乳糖為0.05 g·mL-1，外加氮源-蛋白胨0.04 g·mL-1進行高壓滅菌，冷卻后按15%的接種量制備菌懸液，將已接種的三角瓶放入30℃的恒溫培養箱中培養3 d[3]。

1.3.2 粗酶液的制備

按料液比（V/W）1∶8 加入水和發酵過的麩皮，浸提并勻速攪拌30 min。經4層紗布過濾后即得粗酶液，靜置取上清液保存備用。

1.3.3 乳糖酶的純化

采用無機絮凝劑對粗酶液進行絮凝處理，在溫度20℃，自然pH 下，加入硫酸鋁0.002 g · mL-1，30 min后出現大量沉淀，收集沉淀即為純化的乳糖酶。

1.3.4 乳糖酶活力測定

取試驗液1 mL加入試管中，于30℃水浴中平衡10 min，快速加入ONPG 底物溶液5 mL（已在30℃水浴中達到平衡），混合，精確反應10 min后，迅速加入碳酸鈉溶液2 mL，混合，室溫下靜止；空白管的制備：將添加ONPG底物溶液與碳酸鈉溶液的順序顛倒，其余對樣品的處理不變；用分光光度計在420 nm 處測定樣品和空白液的吸光度；以1 min 內催化ONPG 水解生成1 μmol 鄰硝基酚的酶量為一個酶活力單位[5]。

1.3.5 溫度對酶活性的影響

將提純的酶液在30、40、50、60、70、80℃下與ONPG反應，通過比較相對酶活力的大小，檢測溫度對酶活性的影響。

1.3.6 溫度對酶穩定性的影響

將提純的酶液在30、40、50、60、70℃各處理120 min 后，立即用冷水冷卻，檢測酶活力，通過比較相對酶活力的大小，檢測溫度對酶穩定性的影響。

1.3.7 酶低溫保存穩定性

將粗酶液和純酶液分別在4℃條件下低溫保存，每隔10 d測定其酶活力，通過比較相對酶活力的大小，考察酶的低溫保存穩定性。

1.3.8 pH對酶活性及穩定性的影響

將提純的酶液在不同的pH 下與ONPG 反應，測定其酶活力，通過比較相對酶活力的大小，考察pH對酶活性的影響；將提純的酶液在不同的pH下處理24 h，每隔4 h 測定其酶活力，通過比較相對酶活力的大小，考察pH對酶穩定性的影響。

2 結果與分析

2.1 溫度對酶活性的影響

溫度對乳糖酶活力的影響見圖1。

圖1 溫度對乳糖酶活力的影響

溫度是影響酶活性的較主要因素，通常情況下各種酶都會有一個最適溫度，在此溫度下酶的活力最高。如果溫度太高會影響酶蛋白的次級鍵，使蛋白質變性，降低其酶活性。由圖1可見，亮色毛霉乳糖酶的活性在＜60℃時隨溫度的升高直線上升，＞60℃之后酶活力開始迅速下降，表明其最適作用溫度為60℃，其最適作用溫度較高，屬于高溫乳糖酶，此溫度下可有效防止雜菌的污染。在80℃時酶活力很低，只有最適酶活力的21%，主要是由于高溫使乳糖酶蛋白分子中的氫鍵、離子鍵等非共價鍵的斷裂，破壞了酶蛋白的天然結構從而降低其酶活性。

2.2 酶的溫度穩定性

酶的溫度穩定性見圖2。

圖2 酶的溫度穩定性

從圖2可以看出，在30～50℃時，殘留酶活力約為90%，在60℃下處理相同時間其殘留酶活力為76.54%，在70℃下處理120 min其殘留酶幾乎全部失活。對于普通的酶蛋白質來說，溫度越低穩定性越好，溫度越高熱失活越快。所以酶蛋白大部分需要貯存在較低的溫度條件下。亮色毛霉發酵所獲得的乳糖酶雖然在60℃時的酶活力最高，但是該溫度下，乳糖酶的穩定性較差，其酶活力損失較大，不適合應用于需較長反應時間的工業化生產中，因此從穩定性和最大酶活力兩方面考慮，在工業生產應用中的作用溫度應該選在50℃，而不能采用此乳糖酶最大酶活力時的溫度60℃。在50℃附近既能夠在一定程度上減少雜菌的污染，同時又可以延長其使用時間，降低生產成本。

2.3 酶的低溫保存穩定性

酶的低溫保存穩定性見圖3。

圖3 酶的低溫保存穩定性

由圖3可見，不管是粗酶液還是純酶液都具有較高的低溫穩定性。但純酶液在低溫保存中的損失率要低于粗酶液。純乳糖酶蛋白在低溫貯存20 d后酶活才開始降低。主要是由于純酶液在提純過程中去除了蛋白酶，從而消除了蛋白酶對乳糖酶蛋白的降解作用，從而提高了其穩定性。

2.4 pH對酶活力的影響

pH對酶活力的影響見圖4。

圖4 pH對乳糖酶酶活力的影響

由圖4可見，乳糖酶作用的最適pH為4.5。當pH超過6.0時酶活顯著降低（P＜0.05），主要原因可能是由于酸堿的變化影響酶蛋白活性中心氨基酸殘基的解離情況所引起的。

2.5 pH對酶穩定性的影響

乳糖酶的pH穩定性見圖5。

圖5 酶的pH穩定性

不同的pH 也會對酶的穩定性產生影響。通過對酶的pH穩定性進行測定，可以找到能夠使酶保持相對穩定的pH 條件，使酶達到最大酶活力限度，從而對酶進行貯藏或生產，由圖5可見，pH 穩定性試驗表明，該酶的穩定范圍在4.0～5.5。

3 討 論

目前，工業生產中用于分解乳糖的乳糖酶多從酵母、曲霉菌或乳酸菌中經誘導產酶后提取獲得，但均不耐熱，僅能在常溫下工作[13]。因在常溫下化學反應速度較慢，所需時間長，容易受到細菌污染而發生變質。此外，為縮短水解時間，所需添加的酶量又較大，因此成本也高。而高溫乳糖酶在工業應用中具有突出的優點，如水解溫度高、酶反應速度快、酶用量低、反應時間短、省時省力并且能防止雜菌污染等。因此，高溫乳糖酶的研究日益引起人們的重視。李寧等對黑曲霉D2-26高溫乳糖酶的酶學性質進行了研究，發現其最適溫度為70℃，在30～60℃有較高的耐受性；最適pH為2.5，pH穩定范圍在2.0～9.0；Mn2+對乳糖酶活性有顯著的激活作用（P＜0.05），Hg2+、Pb2+對酶活有較強的抑制作用[14]。蔣燕靈等對從棲熱菌中分離得到的耐熱乳糖酶的理化性質進行了研究，發現該耐熱乳糖酶的等電點約為7.2，不同于其他來源的乳糖酶[15]。史應武等從101株低溫菌中發現了1株產高溫β-半乳糖苷酶菌株G2005，該酶的最適pH為6.5，最適作用溫度為50℃，在30～60℃范圍內，具有較好的穩定性；Mg2+增強酶活，而Hg2+、Gu2+、Mn2+抑制酶活[16]。

本試驗探討了溫度、pH 對亮色毛霉經固態發酵所獲得的高溫乳糖酶的活性及穩定性研究，結果表明，該酶的最適溫度是60℃，此溫度下可有效防止雜菌的生長，降低了生產過程中雜菌污染的風險；在4℃保存中，純酶液、粗酶液的酶活性均呈現較高的穩定性，但純酶液的酶活力變化不大，主要是由于在提純過程中除去了蛋白酶；pH 對酶穩定性范圍是4.0～5.5，在最適pH 4.5 的附近，此酸度下，細菌的生長速度受限，進一步提高產品的保存質量為亮色毛霉乳糖酶的生產和儲藏條件提供了參考依據。

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