應用基因敲除和RNA干擾技術研究睪丸特異性新基因

廉 靖，王朝亮，王 瑞，李 銳，張天標，張衛星

(鄭州大學第一附屬醫院泌尿外科 河南鄭州 450052)

睪丸特異性基因(testis-specific-gene)，是指主要在睪丸組織中表達，而在機體其他組織中不表達或者極低表達的基因。睪丸特異性基因主要與睪丸功能有關，此類基因的正常表達多與睪丸雄激素產生、精子發生有關。部分睪丸特異性基因不僅與睪丸功能有關，還具有其他生物學特性，在機體正常發育過程中起重要作用。利用基因敲除(Gene knockout)技術和RNA干擾(RNA interference)技術選擇性敲除或沉默睪丸特異性基因，并建立目的基因缺失或目的基因表達減弱動物模型是研究此類基因功能的首選方法。

1 基因敲除技術研究睪丸特異性基因功能

基因敲除是根據DNA同源重組的原理而設計的一項技術，通過DNA分子的同源重組，特異性地在基因組的某個位點引入預定的突變，進而獲得基因型發生了改變的基因打靶小鼠，以研究目的基因的體內功能或相關疾病的致病機制［1］。

1.1 精子發生相關的睪丸特異性基因 哺乳類動物的精子發生(spermatogenesis)需經過有絲分裂、減數分裂和精子形成3個階段，最終由二倍體精原細胞形成單倍體精子，此過程必須經歷一系列不同于體細胞發育的生物學事件，包括姐妹染色體遺傳交換、核固縮、染色質重建、頂體和鞭毛形成等［2］。這一獨一無二的發育過程，是大量睪丸特異性基因按時空順序表達與睪丸組織內外環境共同作用的結果，例如，CERM［3］、H1t［4］、MTL-5［5］、Cdc2［6］、Dmcl［7］等皆被證明為睪丸特異性基因并在精子發生過程中起重要作用，這些睪丸特異性基因表達缺失會導致精子細胞數目減少、形態畸形、活動能力下降、凋亡增多，進而導致雄性不育，主要包括以下幾類基因。

1.1.1 影響精子活動能力的睪丸特異性基因:良好的精子活動能力是男性正常生殖的必要條件之一，精子活動能力下降會直接導致男性不育。

近年來，國內外科學家發現了許多影響精子活動能力的睪丸特異性基因。試驗觀察發現，Catsper3、Catsper4基因敲除雄性小鼠和野生型雄性小鼠的睪丸重量、精子計數在8～10周齡沒有顯著差異，但是Catsper3、Catsper4基因缺失雄性小鼠的精子室溫下經過HTF培養基2 h孵育后，其活動精子比率和野生型雄性小鼠相比明顯下降。交配試驗證明，Catsper3、Catsper4基因缺失雄性小鼠不能引起野生型雌性小鼠受孕，上述資料表明，在精子獲能過程中精子超激活需要CatSper3、CatSper4的存在［8］。

另一個和精子活動能力相關的睪丸特異性基因是CD59b，CD59是位于細胞膜上的與陣發性睡眠性血紅蛋白尿(PNH)發病有關的蛋白質。近年來，英國科學家在mRNA和蛋白質水平證明，CD59b基本上僅在成年雄性小鼠的睪丸組織表達，CD59b在其他組織中的微量表達是由血細胞污染引起的。進一步的研究發現CD59b主要在精子的頂體部位表達，其mRNA在睪丸組織中的表達和青春期的發育同步，這些資料表明CD59b很可能與頂體功能有關，CD59b缺失將會導致精子獲能障礙，資料表明睪丸特異性基因CD59b在調節精子活動能力方面具有非常重要的作用，這些發現和以前CD59b基因敲除小鼠模型所證明的(CD59b－/－)雄性小鼠漸進性不育、精子活性減弱相吻合［9］。

1.1.2 影響精子形態的睪丸特異性基因:精子發生過程起始于干細胞的分化，終止于成熟精子的形成，在此過程中，精子形態異常、精子畸形會導致男性不育。

Yan等采用常規的基因敲除技術發現精子細胞成熟因子1(Spem1)基因在小鼠精子細胞胞質去除(Cytoplasm Removal)的基因調控中起重要作用，實驗研究發現Spem1基因敲除雄性小鼠不育，精子胞質去除異常、精子頭部因精子尾巴的纏繞而彎曲畸形［10］。此外，德國科學家在研究睪丸特異性基因Tex18時發現，Tex18基因敲除雄性小鼠生育力低下，進一步的實驗觀察發現Tex18基因敲除雄性小鼠精子頭部畸形，活動能力低下［11］。

1.1.3 影響精子數目的睪丸特異性基因:精子數目減少，是雄性不育的原因之一。美國羅徹斯特大學科學家在研究睪丸孤兒細胞核受體4(TR4)基因時發現TR4在雄性小鼠出生后16～21 d表達量最高，并且TR4特異性、階段依賴性表達于粗線期后期精母細胞和圓形精子細胞，該基因缺失會導致精子發生障礙，精子數目減少，TR4基因敲除雄性小鼠體重下降、睪丸重量減輕、生育力低下、睪丸組織切片結果顯示初級精母細胞變性、部分睪丸精曲小管壞死。與野生型雄性小鼠相比(TR4－/－)雄性小鼠精子發生延遲，進一步的機制研究表明，(TR4－/－)雄性小鼠精子發生延遲由精子發生過程中減數分裂異常引起。此外，對TR4基因敲除雄性小鼠其他基因的表達分析發現，睪丸特異性基因Sperm 1和Cyclin A1在(TR4－/－)雄性小鼠體內表達延遲并同時伴有表達減弱［12］。由此可知，TR4基因是睪丸組織產生正常數目精子所不可缺少的條件之一，TR4基因很可能與Sperm 1和Cyclin A1相互作用，協同促進正常的精子發生過程。

綜上所述，在精子發生過程中有許多睪丸特異性的基因表達，分析睪丸特異性基因表達譜，篩選和鑒定精子發生過程中起重要作用的睪丸特異性基因，研究其特性和功能，對理解精子發生的內在機理、防治由精子發生異常引起的男性不育、研制男性避孕藥等具有重要意義。

1.2 雄激素產生相關的睪丸特異性基因 雄激素對于睪丸發育、第二性征成熟、性欲的維持以及促進精子發生有重要作用。睪酮是男子體內最重要的雄激素，動物體內許多睪丸特異性基因缺失都會影響睪丸合成睪酮的功能或者影響睪酮功能的正常發揮，睪酮濃度過低或者睪酮正常功能發揮受阻，睪丸生精功能就會顯著減退進而導致雄性生殖能力下降。

目前，與睪丸雄激素產生相關的睪丸特異性基因的研究報道不多，近年來，國內外的專家學者通過建立基因敲除小鼠模型發現了許多影響睪丸雄激素合成的基因，如G蛋白偶聯受體GPRC6A基因、組氨酸脫羧酶(HDC)基因、芳香烴受體(AhR)基因等，并初步研究了它們在睪丸雄激素合成過程中的作用。實驗研究發現，GPRC6A基因敲除雄性小鼠睪丸體積、精囊腺重量明顯下降，血液睪酮濃度顯著降低［13］。組氨酸脫羧酶(HDC)基因敲除雄性小鼠睪丸間質細胞的類固醇激素合成能力顯著下降，主要表現為睪丸間質細胞的基礎睪酮分泌水平和在hCG誘導下的睪酮分泌水平都下降［14］，而芳香烴受體(AhR)基因敲除雄性小鼠則有30%表現為血液睪酮濃度顯著下降［15］。由此可知，上述3個基因在睪丸間質細胞功能調節和睪丸類固醇激素的合成過程中具有非常重要的作用。

2 RNA干擾技術研究睪丸特異性基因功能

RNA干擾(RNA interference，RNAi)，又稱為gene knock-down，是發生于動物、植物機體中的轉錄后基因沉默現象，此過程主要由雙鏈RNA(dsRNA)同源互補于靶基因的mRNA來完成。作為現代生物醫學研究的焦點，RNA干擾技術被廣泛應用于勃起功能障礙、前列腺癌和精子發生等方面的研究［16］。RNA干擾技術方便、快捷，克服了基因打靶費時、費用高昂等缺點［17］，是除基因敲除技術外在活體內研究睪丸特異性基因功能的又一方法，國內外研究學者已經利用RNA干擾技術建立了許多睪丸基因表達減弱動物模型，進而揭示目的基因的功能。我國科學家利用RNA干擾(RNAi)技術，研究發現晝夜節律鐘基因與雄性小鼠的生殖功能有關，它很可能通過調節精子頂體蛋白的活性進而影響精子的受精能力［18］。

雖然RNA干擾技術方便快捷，但是由于RNA干擾技術不能作用于所有基因和某些特殊類型的細胞(神經元)，而且RNA干擾技術只是在轉錄后水平上降低目的基因的表達，其基因沉默效果遠不如基因敲除技術干凈徹底，有時也會因基因沉默不徹底導致動物模型表型難以分析。因此RNA干擾技術在研究睪丸特異性基因功能方面的應用遠沒有基因敲除技術廣泛。

3 結語

睪丸的主要功能是分泌雄激素睪酮和產生精子。睪酮不僅參與精子形成，且能促進生殖器官和第二性征的發育，并保持男性特有的生理功能;精子的主要功能是與卵子結合形成受精卵進而產生后代。哺乳類動物的精子發生是一個不同于體細胞分化的特殊過程，這一特殊的細胞分化過程受多種因素的調控，而生精細胞內基因水平的調節，在精子發生過程中起著決定性的作用［19］。

近年來隨著基因克隆、表達及功能研究技術的發展與應用，人們發現了許多與精子發生相關的基因，其中主要是睪丸特異性基因在精子發生中起重要作用。這些睪丸特異性基因具有發育階段特異性和組織細胞特異性的表達特征，并參與精子發生過程中特異的細胞活動。然而對于這一過程中許多關鍵基因及其功能還知之甚少，需要進行更加廣泛深入的研究，基因敲除技術和RNA干擾技術是目前研究基因功能的主要方法技術。近年來，越來越多的睪丸特異性基因逐漸被人們發現，如 TSF22［20］、BAFL、T490、TSC21、TSC23、TSC43、RGS22［21］、TDRG1［22］、TSEG-2［23］、TSAF76、mtIQ1［24］、mtIQ2等，進一步探討其基因表達模式、研究其功能特性將有助于我們更好的了解它們在男性生殖方面所起的作用，為男性疾病的治療開辟新的道路。

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