自身抗體檢測的臨床應用與質量控制

萬本愿，李勝遠，姜青龍綜述

(江西省臨床檢驗中心，江西南昌330006)

自身抗體檢測的臨床應用與質量控制

萬本愿，李勝遠，姜青龍綜述

(江西省臨床檢驗中心，江西南昌330006)

自身免疫性疾病(AID)是指機體對自身抗原發生免疫反應而導致自身組織損害所引起的疾病。檢測項目包括：抗核抗體(ANA)、抗可提取性核抗原抗體(ENA)、抗嗜中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)等近百種自身抗體。檢測方法主要有間接免疫熒光法、酶聯免疫吸附法、免疫印跡法等多種方法。試驗場所與試驗過程中的顯微鏡、酶標儀、試劑盒、質控品等均應符合要求，人員應按標準操作程序操作,并做好自身抗體的全面質量控制。

自身免疫性疾病；質量控制

自身免疫性疾病(autoimmune diseases，AID)是指機體對自身抗原發生免疫反應而導致自身組織損害所引起的疾病。自身抗體的存在與自身免疫性疾病并非兩個等同的概念，自身抗體可存在于無自身免疫性疾病的正常人，特別是老年人，如抗甲狀腺球蛋白、甲狀腺上皮細胞、胃壁細胞、單鏈-DNA抗體等。近年來，自身抗體檢測在診斷自身免疫性疾病、判斷疾病的活動程度、觀察治療效果、指導臨床用藥等具有重要的作用。由于不同實驗室可能采用不同的抗原基質，即使同樣的抗原基質，其抗原固定方法也有差異或不同。另外，由于不同的血清稀釋方法以及操作者對不同熒光模式的識別能力的不同，均可影響到自身抗體的檢測質量。

1 常見自身抗體檢測的臨床應用

大多數自身免疫性疾病患者的血清中可檢測到高效價的自身抗體，雖然有些自身抗體在疾病中的作用尚未被證實，但其與疾病的相關性已獲得認可。特別是有些自身抗體的檢測已納入到某些自身免疫性疾病的診斷標準中，這些自身抗體的檢測對自身免疫性疾病的診斷和鑒別診斷及愈后評估具有重要的臨床意義。隨著對自身抗體的了解越來越深入，臨床應用越來越廣泛，免疫學技術進一步的提高，自身抗體檢測已是臨床免疫檢測的一項重要的實驗室指標。在診斷自身免疫性疾病、判斷疾病的活動程度、觀察治療效果、指導臨床用藥等具有重要的臨床意義。筆者簡單介紹一下自身抗體的臨床應用。

1.1 抗核抗體(antinuclearantibody，ANA)是一組針對自身真核細胞的各種細胞核成分為靶抗原的自身抗體的總稱。ANA的性質主要是IgG、也有IgM、IgA和IgD。其無器官和種屬的特異性，故該類抗體可與所有動物的細胞核發生反應[1,2]。現已證實ANA對很多自身免疫性疾病有診斷價值，在不同疾病中，特別是在風濕性疾病中，其抗體譜有一定的特征性。此外，在橋本甲狀腺炎、重癥肌無力、多發性動脈炎等患者中也可能檢測出ANA。ANA陽性已被美國風濕病學會列位SLE的診斷標準之一。

1.2 抗雙鏈DNA抗體(double-strandedDNA，ds-DNA)抗體與細胞核的反應位點是位于DNA(外圍區)脫氧核糖磷酸框架上，又稱為天然DNA抗體,其靶抗原為雙螺旋DNA.對診斷SLE有較高的特異性，是SLE患者的特征性標志抗體。30%-90%的活動期SLE患者此抗體陽性。且抗體滴度的消長與SLE的活動程度相關。隨著疾病活動的控制，抗ds-DNA抗體滴度可以下降或消失，可作為治療監測和預后評價的指標。抗ds-DNA抗體與DNA結合成為免疫復合物在腎小球基底膜沉積，或抗ds-DNA抗體直接作用于腎小球抗原造成SLE患者的腎損害。抗ds-DNA抗體陽性的患者較陰性患者發生腎炎的危險性高12倍[3]。

1.3 抗單鏈DNA(singlestrand-DNA,ss-DNA)抗體又稱為變性DNA抗體,其靶抗原為核糖或脫氧核糖。在SLE患者有較高的檢出率(50%～60%)，但結果缺乏疾病特異性，在其他風濕病如混合性結締組織病，藥物誘導的狼瘡，硬皮病，皮肌炎，干燥綜合征，類風濕性關節炎等也有10%～70%的檢出率，有些正常老年人也存在[4]。

1.4 抗可提取性核抗原抗體(Anti extractable nucle-

arantigen antibody，ENA)此類抗蛋白可以溶于鹽水而被提取，故稱為可提取性核抗原。ENA是可提取核抗原的總稱，ENA屬非組蛋白的核蛋白，屬酸性蛋白抗原，是由許多小分子RNA(約100~215個核苷酸)與各自對應的特定蛋白質組成的核糖核蛋白顆粒(RNP)，該組成使其各自的抗原性得以增強，分子中不含DNA。主要包括Sm、RNP、SSA、SSB、Jo-1、Scl-70抗原，不同的自身免疫性疾病可產生不同的抗ENA抗體。對彌漫性結締組織病的診斷尤為重要，但與疾病的嚴重程度及其活動度無明顯關系[5]。

1.5 抗嗜中性粒細胞胞漿抗體(anti neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA)是一組以人嗜中性粒細胞胞漿成分為靶抗原的抗體，ANCA是系統性血管炎的血清標志性抗體。ANCA有兩種類型:一種是細胞質型(cytoplasmic ANCA，c-ANCA)；目前認為它即是嗜中性粒細胞嗜天青顆粒內的，稱之為蛋白酶3(porteinase3)的中性蛋白酶；一種是核周型(perinuclear ANCA，p-ANCA)，p-ANCA的靶抗原比較復雜，主要有髓過氧化酶(MPO)、組織蛋白酶G、彈性蛋白酶、溶菌酶和乳鐵蛋白等。與臨床多種小血管炎性疾病密切相關，c-ANCA陽性最主要見于Wegener肉芽腫以及全身性血管炎，特異性＞97%，敏感性在初發非活動期患者為50%，活動期患者可達100%。p-ANCA多見于顯微鏡下多血管炎、變態反應性肉芽腫性脈管炎、壞死性新月體型腎小球腎炎[6]。

1.6 類風濕因子(rheumatoid factor,RF)是一種抗人或動物IgG分子Fc片段抗原決定簇的抗體，是以變性IgG為靶抗原的自身抗體，無種族特異性。與RA高度相關，70～90%的RA患者為RF陽性，是類風濕性關節炎診斷標準之一。但RF陰性不能排除RA的診斷。除RF外，還有很多疾病RF陽性，如干燥綜合癥，混合性結締組織病，2型混合性冷球蛋白血癥，慢性活動性肝炎，亞急性戲劇性心內膜炎，全身性紅斑狼瘡，多種細菌、真菌、螺旋體、寄生蟲、病毒感染。因此，RF陽性時應結合臨床全面檢查，對其臨床意義作出綜合分析[7,8]。

1.7 抗角蛋白抗體(antikeratin antibody,AKA)又稱為抗絲集蛋白抗體(anti-filaggrin antibody,AFA)或抗角質層抗體(anti corneum antibody,ASCA),AKA主要見于類風濕性關節炎患者。在非類風濕性關節炎的自身免疫病患者AKA的陽性檢出率極低。AKA與RF在診斷RA時具有顯著的相關性[10]。

1.8 抗環瓜氨酸肽抗體(anti-cyclic citrullinated peptide antibody，CCP)研究發現絲集蛋白中的瓜氨酸是抗原性表位的主要成分，用合成的環化瓜氨酸多肽(CCP)作為抗原基質檢測。抗環瓜氨酸肽抗體的檢測，是用于風濕性關節炎(RA)早期診斷的一個高度特異的新指標，敏感性為50～78%，特異性為96%，早期患者陽性率可達80%[11,12]。

1.9 抗肝抗原自身抗體有多種，包括抗肝特異性脂蛋白(LSP)抗體、抗肝細胞膜抗原(LMA)抗體、抗線粒體抗體(AMA)、抗肝腎微粒體(LKM)抗體、抗平滑肌抗體(ASMA)和抗可溶性肝抗原和肝胰抗原(SLA/LP)抗體等。這些自身抗體在區分病毒性肝炎及自身免疫學肝炎(AIH)分型中具有重要的臨床意義[13-15]。

1.10 抗胰島細胞抗體(anti islet cell antibody,ICA)是胰島素依賴型糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus,IDDM)患者中最常見的自身抗體。新確診的IDDM患者其APICA的陽性檢出率可達90%以上。通常在治療一年后該抗體水平下降[16]。

2 自身抗體的檢測方法

2.1 間接免疫熒光法(indirect immunofluorescent method,IIF)是一種作為總的ANA篩選的經典試驗，IIF檢測在過去最常用小鼠肝細胞印片作為抗原底物片，目前最常用的是核質豐富的培養細胞—Hep-2細胞作為抗原。培養Hep-2細胞作為底物固定于載玻片上，與受檢血清反應，血清中ANA與核抗原結合，形成抗原-抗體復合物，此時再加入FITC標記的抗人IgG，標記抗人IgG與抗原-抗體復合物結合形成標記抗體-抗原-抗體復合物，在熒光顯微鏡下可觀察到底物片上ANA熒光著染強度和免疫熒光圖形。

2.2 酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbant assay，ELISA)酶免疫測定是將抗原抗體反應的高度特異性和酶的高效催化作用相結合，發展建立的一種非放射性標記免疫分析方法。由于ELISA具有靈敏度高、特異性強，酶免疫試劑的性質比較穩定，操作方法簡便快速、無放射性污染以及應用范圍廣等很多優點，是目前應用最為廣泛的一項免疫學實驗。由于純化的或重組的抗原生產技術的成熟，商品化用于自身抗體檢測的高質量的試劑盒已日漸增多，該法檢測自身抗體快速、敏感性及特異性強。由于該檢測方法的靈敏度高、特異性強、可量化且排除了人為的主觀判斷，費用低廉，是目前國外大多數自身免疫診斷檢測實驗

室的首選檢測方法。

2.3 免疫印跡法(Western-blot,WB)是屬于膜載體酶免疫技術，其固相載體為吸附有抗原的硝酸纖維膜。其基本原理是將從小牛或兔胸腔提取的ENA抗原，經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)，按分子量大小分離成區帶，經參照對應分子量標準物質確定每一抗原區帶的分子量。然后將各抗原區帶轉印至硝酸纖維膜上制成抗原吸附載體膜。將待檢血清加在已切成細條的硝酸纖維膜上，待檢血清中存在的抗ENA抗體分別與硝酸纖維膜上的相應抗原區帶結合，當再加入酶標記抗人IgG抗體后形成抗原-抗體-酶標記抗體復合物，再加入酶的底物，出現顯色反應，參照此時抗原區帶的分子量及各區帶的相對位置，可辯讀出各特異性抗ENA抗體。主要用于ANA陽性患者對單一抗原成分特異性自身抗體的確診分析[17]。

2.4 放射免疫法(Radioimmunoassay,RIA)是用放射性物質標記的抗體對待檢樣品中抗原成分進行測定的方法。

2.5 免疫斑點法(Immunodot assay,IDA)這是免疫印跡法的一種改進的方法。將多種親和層析純化的、生化性質明確的核抗原平行包被到膜條上作為固相，可用于抗ENA抗體的檢測[18]。

3 自身抗體檢測的質量控制

自身抗體檢測的質量控制(QuanlityControl,QC)是保證實驗結果準確性的重要環節，同時也是衡量實驗室檢測水平的一個重要指標。由于自身抗體檢測多為定性實驗或半定量實驗(以滴度報告)，特別強調每次實驗中應同時設置檢測陽性對照，陰性對照，以監測結果的準確性。同時，也便于對實驗室內部、實驗室之間質量控制的可比性、重復性進行評估。

3.1 自身抗體檢測的器材的要求(1)實驗室應有充分的空間、良好的照明和空調設備；設施和設備配備合理，能滿足自身抗體檢測的要求。(2)微量加樣器必須定期進行校準，從而使其保持有足夠的準確度和精密度。(3)熒光顯微鏡的質量和熒光光源的強度是保證良好分辨率的基礎。(4)酶標儀應定期校準，制定標準操作程序和嚴格的維護保養措施。(5)檢測用試劑盒必須由具有相關資質的廠家提供，并按規定保存。(6)每家開展檢測的實驗室都應對廠家推薦的熒光標記物的稀釋方法進行評價，應用已知滴度的陽性血清去滴定標記物，以建立操作過程中的正確稀釋方法。(7)質控品應與患者標本在同樣條件下進行測定，并要特別注意質控品的保存條件和保質期，不得使用保存不當和超過保質期的質控品。(8)每家開展檢測的實驗室都應建立其自身抗體檢測項目的標準操作規程文件。(9)相對固定檢測人員，并嚴格按照SOP文件要求進行檢測。陽性結果最好與該患者過去檢測檔案進行復核后再發出結果。(10)開展自身抗體檢測的實驗室在保證室內質控的同時，應參加國家或國際權威組織的室間質量評價。

3.2 實驗基質的選擇要求

3.2.1 實驗基質的選擇實驗基質的質量在很大程度上取決于間接免疫熒光法對自身抗體進行測定的效果。自身抗體檢測中的實驗基質，一般用動物或人類的細胞或組織，須經一系列方法進行處理，如HEP-2細胞的培養、吸附和固定，冰凍組織切片的制備、貼片等。越來越多的實驗室已經使用商品化的自身抗體間接免疫熒光檢測試劑盒。由于生產工藝先進，質控措施嚴格，從而保證了實驗結果準確的可信性。檢測不同的自身抗體應選擇不同來源的實驗基質，如檢測ANA一般用人上皮HEP-2細胞和靈長類動物肝臟。而器官和組織特異性自身抗體則選用相應的抗原器官組織。

3.2.2 熒光標記二抗的選擇在自身抗體檢測中，熒光標記二抗的質量直接影響實驗的結果。熒光素與第二抗體的偶聯需要保持一定的摩爾比值(F/ P,熒光素/抗體蛋白比值)，F/P值過高將產生明顯的非特異性熒光。

3.3 結果的判斷和解釋

3.3.1 結果的判斷實驗條件及檢測試劑盒在規定條件下，待檢血清在合適的起始稀釋度下，實驗基質沒有可辨認的熒光染色模式時，即與陰性對照比較在同一水平，判為陰性；實驗基質產生可辨認的特異性熒光染色模式時，即可于陽性對照比較在同一水平或高于陽性對照的水平，判為陽性。通過自身抗體效價與滴度消長，可判斷疾病的活動性，觀察治療反應，指導臨床治療。檢驗報告中必須描述每個圖型及其滴度；有的圖型與疾病有相關性，也可提示做特異性免疫檢測。

3.3.2 結果解釋應結合相應的熒光模式、自身抗體水平、患者年齡等幾方面進行綜合分析。正常老年人，尤其是女性可出現低滴度的自身抗體(1:80)；相反,年齡較小的患者當其滴度在1:40時也應進一步篩查(尤其是女性患者)；但一些無癥狀患者也可出現自身抗體的低滴度陽性。因此，有些自身抗

體檢測的結果必須根據患者的臨床表現進行分析[19]。如遇到圖型不典型、意義不明確，也應在檢驗報告中有注解，以便臨床醫師知曉；檢驗報告應由資深人員出具；各實驗室應建立自己的參考區間。

[1]Muratori P,Granito A,Pappas G,etal.Autoimmune liver disease 2007[J].Mol Aspects Med,2008,29(1-2):96-102.

[2]Qiu DK,Li XM,Wei J,et al.Clinical features of 107 autoimmune hepatitis patients and 30 of them with AIH-primary biliary cirrhosis overlap syndrome[J].Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi, 2008,16(5):367-371.

[3]蔣明,DAVIDYU,林孝義,等.中華風濕病學[M].北京:華夏出版社，2004:865-942.

[4]孫衛民,王惠琴.細胞因子研究方法學[M].北京:人民衛生出版社，1999:467-473

[5]馬東來,張少靜,文夫瑞德·斯特克.自身抗體及其免疫熒光模式[M].北京:北京科學技術出版社,2000.

[6]楊程德，顧越英.抗嗜中性粒細胞胞漿抗體的檢測及臨床意義［J］.中國實用內科雜志，2002,22(1):46-48.

[7]田新平,蔣明,宋琴芳,等.類風濕關節炎患者RA33/36抗體、角質蛋白抗體及抗核周因子的相關性初步研究[J].中華微生物學和免疫學雜志,1998,18(2):54-56.

[8]許榮,周麗萍,鐘麗民.IgG-RF定量測定在類風濕關節炎關節外病變中的應用[J].上海醫學檢驗雜志,1999,14(4):228-229.

[9]劉巧紅,沈凌汛,吳清敏.類風濕關節炎患者血清腫瘤壞死因子α、白細胞介素-6的檢測及其臨床意義[J].臨床內科雜志,1998(6): 307-308.

[10]周厚清,吳瑾濱,董敏.類風濕因子陰性類風濕關節炎患者血清抗環瓜氨酸肽和蛋白抗體、IL-10及IL-18檢測分析[J]．國際檢驗醫學雜志，2011,32(13:)1441-1442.

[11]Feitsma A L,Toes R E,Begovich A B,et al.Risk of progression from undifferentiated arthritis to rheumatoid arthritis:the effect of the PTPN22 1858T-allele in anti-citrullinated peptide antibody positive patients[J].Rheumatology(Oxford),2007,46(7):1092-1095.

[12]任天麗,石國勛.血清抗環瓜氨酸肽抗體在類風濕關節炎診斷中的評價[J]．診斷學理論與實踐，2006，5(4):305.

[13]范列英,仲人前,趙文靜,等.慢性肝病和原發性肝癌患者血清抗核抗體檢測及其臨床意義[J].上海免疫學雜志,2000(2):120-121.

[14]Strassburg CP,Alex B,Zindy F,et al.Identification of cyclin A as a molecular target of antinuclear antibodies(ANA)in hepatic and non-hepatic autoimmune diseases[J].J Hepatol,1996,25(6):859-866.

[15]Numata T,Kato J,Kohgo Y,et al.Autoantibody against a 78 kDa membrane protein of HepG2 cell in the sera of patients with alcoholic liver diseases[J].J Gastroenterol,1995,30(6):751-757.

[16]逢力男,董硯虎,李在連,等.抗胰島細胞抗體:Ⅰ型糖尿病的免疫學標志[J].國外醫學(免疫學分冊),1993(5):232-235.

[17]王蘭蘭.臨床免疫學及免疫檢驗[M].第3版.北京：人民衛生出版社，2003:190-199.

[18]葉應嫵，王毓三，申子瑜.全國臨床檢驗操作規程[M].第3版.南京：東南大學出版社，2006：651-675.

[19]王蘭蘭.自身抗體檢測的應用與質量保障原則[J].中華檢驗醫學雜志,2005,28(10):17-20.

R446.62,R593.2

A

1674-1129(2013)01-0052-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.01.018

萬本愿，男，1954年生，本科，主任技師，主要研究方向為臨床化學、分子生物學及實驗室質量管理。