HDACI、8在肺泡II型上皮細胞間質轉化中的表達及意義

姜巍，徐國萍

（1.大理學院臨床醫學院，云南大理671000；2.大理學院基礎醫學院，云南大理671000）

HDACI、8在肺泡II型上皮細胞間質轉化中的表達及意義

姜巍1，徐國萍2*

（1.大理學院臨床醫學院，云南大理671000；2.大理學院基礎醫學院，云南大理671000）

目的：觀察TGF-β1作用下，肺泡Ⅱ型上皮細胞RLE-6TN在EMT過程中HDAC1、8的表達情況及TSA對TGF-β1誘導細胞EMT的影響。方法：將TGF-β1加入到體外培養的細胞中，于不同時間收取細胞，采用WB及Real-time RT-PCR檢測HDAC1、8及E-cad、α-SMA的表達情況。然后將TGF-β1加入經過TSA預處理的細胞中，于不同時間收取細胞，重新檢測上述基因。結果：加入TGF-β1后，E-cad蛋白表達下調；α-SMA蛋白表達上調；HDAC1蛋白表達上調；HDAC8蛋白表達下調。E-cad mRNA表達下調α-SMA及HDAC8的mRNA均于12 h表達上調，6 h、24 h表達下調；HDAC1 mRNA表達于6 h下調，24 h上調。加入TSA后，E-cad蛋白表達上調；α-SMA、HDAC1及HDAC8蛋白的表達均下調。E-cad mRNA表達上調；α-SMA mRNA表達于6 h、12 h上調，24 h下調；HDAC1 mRNA表達下調；HDAC8 mRNA表達上調。結論：TGF-β1體外誘導的RLE-6TN細胞EMT，可以通過應用TSA抑制其獲得α-SMA表型、失去E-cad表型，從而部分逆轉TGF-β1誘導的肺泡Ⅱ型上皮EMT。

HDAC1；TGF-β1；TSA；肺泡Ⅱ型上皮細胞；EMT

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是各種間質性肺疾病所引起的慢性肺部疾病的共同結局，嚴重威脅著人類的健康。與其他器官纖維化一樣，PF涉及到細胞、細胞因子、EMT（Epithelial-Mesenchymal Transition）等的共同參與〔1〕。EMT是指上皮細胞失去其特有的表型（E-cad），獲得新的表型（α-SMA），轉化為間質細胞。EMT參與調控器官的發生和其它生理病理過程，包括器官纖維化。組蛋白去乙酰化酶（HDACs）也在這些相關的過程中起著重要作用〔2〕。HDACs是平衡染色質重塑中組蛋白乙酰轉移酶（HAT）乙酰化活動的酶類，二者間平衡在特定條件下被破壞，就會導致基因轉錄的失調及信號轉導改變，從而引起基因表達異常，這種異常在纖維化和癌癥的發生和發展中起著重要作用〔3〕。近年的研究表明，HDAC1在TGF-β1誘導的肝細胞EMT過程中發揮重要作用〔2〕，但是HDAC是否參與了肺泡上皮細胞EMT進程目前尚不清楚。本研究擬通過在體外培養大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞中加入TGF-β1，觀察HDAC1、8和E-cad、α-SMA的表達情況，然后加入組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA，觀察其對TGF-β1誘導的EMT的影響，探討HDAC1、8在肺泡上皮細胞EMT過程中的作用及其機制，為肺纖維化的治療開辟一條嶄新道路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞培養SV40永生化大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞系RLE-6TN購自美國ATCC，細胞在37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基培養。

1.1.2 主要試劑TGF-β1購自R&D公司，單克隆抗E-cadherin抗體購自BD公司，單克隆抗α-SMA抗體及TSA購自Sigma公司，多克隆抗HDAC1、8抗體購自Proteintech Group公司，引物采用Primer3.0軟件設計并由上海生工生物技術有限公司合成，RT-PCR Kit購自大連Takara公司。

1.1.3 主要儀器二氧化碳培養箱（Thermo Forma公司，USA），相差顯微鏡（Nikon，Japan），垂直式電泳儀及半干式轉移儀（BIO-RAD），7900HT Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystem，USA）。

1.2 方法

1.2.1 觀察TGF-β1作用下，細胞的E-cad、α-SMA、HDAC1及HDAC8的表達情況

1.2.1.1實驗分組實驗分為：空白對照組、TGF-β1（3 ng/mL）誘導組。

1.2.1.2Western blot檢測當細胞生長至70%~ 80%融合后加入含0.5%FBS的靜止液同步化作用24 h，換成含TGF-β1（3 ng/mL，下同）的靜止液分別作用0、12、24、48、72 h后裂解細胞提取總蛋白，BCA法測定濃度后取40 μg樣品進行10%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠變性電泳，然后轉至PVDF膜，加入一抗，37℃1 h，4℃過夜。洗滌后加二抗，室溫45 min，加入發光液后封膜、顯影。掃描圖像結果，并用Quantity-One軟件計算灰度值。

表1 RT反應體系

表2 PCR反應體系

1.2.2 觀察HDACi對TGF-β1誘導的細胞EMT的影響

1.2.2.1實驗分組實驗分為：空白對照組、TGF-β1組、TSA組及TSA與TGF-β1共用組。

1.2.2.2Western blot檢測當細胞同步化作用24 h后，于新鮮靜止液中加入TSA（300 nM，下同）預處理6 h，而后加入TGF-β1，余步驟同1.2.1.2。

1.2.2.3Real-time RT-PCR檢測當細胞同步化作用24 h后，于新鮮靜止液中加入TSA預處理6 h并加入TGF-β1，余步驟同1.2.1.3。

1.2.3 統計學處理多組比較采用單因素方差分析及Post Hoc檢驗，用SPSS19.0統計軟件處理數據。

2 結果

2.1 TGF-β1對細胞EMT標志物及HDAC1、8表達的影響與對照組相比，上皮細胞標志物E-cad蛋白表達下調，以48 h最明顯，為對照組的0.37倍（P<0.05）；間質細胞標志物α-SMA蛋白表達上調，以48 h最明顯，為對照組的2.87倍（P<0.01）；HDAC1蛋白表達上調，以24 h最明顯，為對照組的1.28倍（P<0.01）；HDAC8蛋白表達上調，其中以72 h上調為對照組的1.19倍（P<0.01）最明顯。見圖1。

圖1 TGF-β1對細胞EMT標志物及HDAC的表達情況

與對照組相比，E-cad mRNA的表達于6、12 h下調，分別為對照組的0.41倍、0.39倍，24 h上調，為對照組的1.1倍；α-SMA mRNA的表達于6、24 h下調，分別為對照組的0.79倍、0.88倍，12 h上調，為對照組的1.6倍；HDAC1 mRNA的表達6 h是下調的，為對照組的0.65倍，24 h是上調的，為對照組的1.3倍；HDAC8的表達于6、24 h下調，分別為對照組的0.68倍、0.95倍，但差異無統計學意義。見表3。

表3 TGF-β1對細胞EMT標志物及HDAC1、8表達的影響

2.2 TSA對TGF-β1誘導的細胞EMT的影響與對照組相比，加入TSA后，E-cad蛋白表達是上調的，以72 h為對照組的1.3倍（P<0.01）最為明顯α-SMA、HDAC1及HDAC8蛋白的表達均是下調的，其中α-SMA于24 h為對照組的0.70倍（P< 0.01）；HDAC1于12 h為對照組的0.78倍（P< 0.01）；HDAC8于24 h為對照組的0.45倍（P<0.01）最為顯著。見圖2。

圖2 TSA對TGF-β1誘導的細胞EMT的影響

與對照組相比，加入TSA后，E-cad mRNA的表達是上調的，為對照組的3.83倍、2.78倍、1.67倍；α-SMA mRNA的表達于6、12 h上調，分別為對照組的1.53倍、1.18倍，24 h下調，為對照組的0.7倍；HDAC1 mRNA的表達是下調的，分別為對照組的0.92倍、0.58倍、0.38倍。HDAC8的mRNA表達是上調的，分別為對照組的1.64倍、2.33倍、1.8倍但差異無統計學意義。見表4。

表4 TSA對TGF-β1誘導的細胞EMT的影響

3 討論

肺間質纖維化時，其病灶內出現大量成肌纖維細胞（Myofibroblast，MFb）聚集，研究表明MFb是肺纖維化時主要的效應細胞。MFb的來源除了肺內固有的間充質細胞外，部分來自肺泡上皮細胞的的間質轉變〔1〕。TGF-β1是一種最主要的促纖維化因子，在EMT過程中起著重要作用〔4〕，且這種轉變是細胞內不同信號通路整合的結果〔5〕。本實驗中，加入TGF-β1后，E-cad表達下調，α-SMA表達上調，細胞發生了EMT，這與文獻報道〔6〕一致。

在表觀遺傳學中，基因的表達調控包括磷酸化、甲基化和乙酰修飾化等，其中組蛋白乙酰化和去乙酰化是最主要的方式，是基因表達的主要動力〔7〕。HDAC1已經被證明其在核小體組蛋白末端的去乙酰化作用中導致了組蛋白核心周圍的DNA被包裹得更加緊密，而這個結果反過來導致了基因轉錄的抑制〔8〕。有研究表明，HDAC1參與調控EMT，能夠抑制ZO-1和E-cad的啟動子活性，并且在TGF-β1誘導的肝細胞EMT過程中是必須的〔2〕。本實驗中加入TGF-β1后，肺泡Ⅱ型上皮細胞發生了EMT轉變，在此過程中，觀察到HDAC1的表達上調，表明HDAC1可能通過抑制E-cad基因啟動子活性參與TGF-β1誘導的EMT過程。同時，當肺泡上皮向間質細胞轉變過程中，HDAC8表達上調并與α-SMA共表達與胞質內，呈細胞骨架樣分布〔9〕，這與有研究表明在前列腺組織中HDAC8只表達在間質細胞及血管壁細胞中〔10〕的報道一致。

TSA是應用最廣泛的HDACi，是一種非競爭性可逆的HDAC活性抑制劑，可以抑制I類和II類HDAC〔11〕。本實驗中，加入TSA后，HDAC1、8的表達均下調，證明了其對HDAC1、8的抑制性，這種抑制性是通過減少轉錄因子SP1的表達水平來抑制TGF-β1誘導的Ⅰ型膠原在MFb上的表達〔12〕。正是由于TGF-β1的作用被抑制，從而抑制了EMT，這說明TSA可以抑制細胞發生EMT。實驗中加入TSA后，HDAC8的mRNA表達上調與蛋白表達不一致可能是由于蛋白在翻譯過程中部分修飾被抑制而mRNA的轉錄未被抑制有關，這種情況是否也發生在其它HDACi中以及具體機制尚需進一步研究。

綜上所述，TGF-β1體外誘導的RLE-6TN細胞EMT，可以通過應用TSA部分逆轉，進而達到抑制EMT、降低肺纖維化發病風險的目的。而抑制HDAC1、8的活性將可能成為抗纖維化治療新的分子靶點。

〔1〕Brigham C，Willis.Induction of Epithelial-Mesenchymal Transition in Alveolar Epithelial Cells by Transforming Growth Factor-beta1〔J〕.American Journal of Pathology，2005，166（5）：1321-1332.

〔2〕Lei Weiwei，Zhang Kehua，Song Jianguo，et al.Histone deacetylase 1 is required for transforming growth factorβ1-inducedepithelial mesenchymal transition〔J〕.The International Journal of Biochemistry&Cell Biology 2010，42：1489-1497.

〔3〕Pang Maoyin，Zhuang Shougang.Histone Deacetylase：A Potential Therapeutic Target for Fibrotic Disorders〔J〕.The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 2010，335（2）：266-272.

〔4〕Kim K K，Kugler M C，Wolters P J，et al.Alveolar epithelial cellmesenchymaltransitiondevelopsinvivoduring pulmonary fibrosis and is regulated by the extracellular matrix〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103：13180-13185.

〔5〕徐國萍，高不郎，許祖德.TGF-β1與EGF對肺泡Ⅱ型上皮細胞表型及功能的影響〔J〕.大理學院學報，2011，10（6）：17-20.

〔6〕徐國萍，李清泉，曹汐汐，等.Smad7對轉化生長因子β1誘導的肺泡上皮細胞向間質細胞轉變的影響〔J〕.中華醫學雜志，2007，87（27）1918-1923.

〔7〕Minucci S，Pelicci P G.Histone deacetylase inhibitors and the promise of epigenetic（and more）treatments for cancer〔J〕.Nat Rev Cancer，2006，6：38-51.

〔8〕Glozak M A，Sengupta N，Zhang X，et al.Acetylation and deacetylation of non-histone proteins〔J〕.Gene，2005，363 15-23.

〔9〕David Waltregny，Wendy Glénisson，Siv Ly Tran，et al. HistonedeacetylaseHDAC8associateswithsmooth muscle α-actin and is essential for smooth muscle cell contractility〔J〕.The FASEB Journal，2005，19（8）：966-968.

〔10〕David Waltregny，Laurence de Leval，Wendy Gle`nisson et al.Expression of Histone Deacetylase 8，a ClassⅠHistoneDeacetylase，IsRestrictedtoCellsShowing Smooth Muscle Differentiation in Normal Tissues〔J〕. American Journal of Pathology，2004，165（2）：553-562.

〔11〕Yoshida M，Kijima M，Akita M.Potent and specific inhibition of mammalian histone deacetylase both in vivo and in vitro by trichostatin A〔J〕.J Biol Chem，1990，265：17174-17179.

〔12〕Ghosh A K，Mori Y，Dowling E，et al.Trichostatin A blocks TGFbeta-inducedcollagengeneexpressioninskin fibroblasts：involvement of Sp1〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2007，354：420-426.

（責任編輯 董杰）

Expression and Significance of Histone Deacetylase 1,8 in Alveolar Epithelial Type II Cells Mesenchymal Transition

JIANG Wei1,XU Guoping2*
（1.Clinical College,DaliUniversity,Dali,Yunnan 671000,China;2.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To observe the expression of histone deacetylase 1,8 on the process of TGF-β1 induced type II alveolar epithelial cells to EMT,and investigate the effect of TSA on TGF-β1-induced the cells EMT process.Methods:RLE-6TN cell lines were cultured and treated with TGF-β1,and collected cells at different time points.The expression of markers and mRNA of E-cad α-SMA，HDAC1 and HDAC8 were assayed by Western Blot and Real-time RT-PCR,respectively.Then add TGF-β1 to the cells after TSA pretreatment for 6 hours and repeat the above assay.Results:With the treatment of TGF-β1,the expression of E-cad protein was down regulated;α-SMA,HDAC1 and HDAC8 protein was unregulated.E-cad mRNA was down regulated;both the mRNA of α-SMA and HDAC8 were up regulated at 12 h,and were down regulated at 6 h,24 h;HDAC1 mRNA at 6 h were down regulated,24 h was up regulated.After pretreated with TSA,the expression of E-cad protein was up regulated;α-SMA,HDAC1 and HDAC8 protein was down regulated.E-cad mRNA was up regulated;α-SMA mRNA at 6 h,12 h was up regulated,24 h was down regulated;HDAC1 mRNA was down regulated;HDAC8 mRNA was up regulated.Conclusion:It is possible to use TSA inhibited RLE-6TN cells to receive α-SMA phenotype,loss of E-cad phenotype,which partially reverse the EMT of RLE-6TN induced by TGF-β1 in vitro.

HDAC1;TGF-β1;TSA;alveolar epithelial type II cells;EMT

R563.1+3

A

1672-2345（2013）03-0016-04

國家自然科學基金青年科學基金資助項目（81100045）

2013-10-15

姜巍，碩士研究生，主要從事外科學研究. *通信作者：徐國萍，教授.