長距離實時定量PCR技術及其在DNA損傷研究中的應用

梁姣 王淑紅 張子平 王藝磊

（1.集美大學水產學院，廈門 361021；2.西東大學生物系，新澤西州 07079）

DNA作為生物機體中重要的遺傳物質，其本身攜帶著生命體所有的遺傳信息，DNA的完整性關系到生物體的生長、發育、遺傳、代謝和繁殖等多種重要的生物學過程。然而，生物機體在自身復制、轉錄過程中以及暴露于各種外界環境下，極易受到體內或外界因素的影響而產生DNA損傷，正常情況下，大部分的損傷能夠被細胞識別并予以修復，但當DNA損傷比較嚴重或機體DNA損傷修復能力缺失，機體無法正常修復時，帶有這種損傷的DNA就會進入半保留復制過程，很容易發生堿基錯配，從而引起細胞凋亡，甚至促使機體形成腫瘤，以及形成各種治療癌癥細胞的阻力［1-4］。

造成生物機體DNA損傷的因素有很多。生物體氧化-還原反應代謝過程中產生的自由基，DNA自身在復制重組過程中發生的錯配，堿基替換，另外在電離輻射和紫外線照射情況下也會產生氧自由基，環境中化學物質亦能造成一定程度的DNA損傷。常見的DNA損傷會引起腫瘤、癌癥［5，6］、糖尿病、心血管疾病及神經退行性疾病等［7-10］。因此，DNA損傷作為外來化合物對機體毒性作用的一個指標，在分子毒理上的應用越來越廣泛。同時，DNA損傷也被用于環境化學物的遺傳毒性、生物個體環境暴露水平和腫瘤罹患危險度的評價。

1 DNA損傷的類型

外來化合物引起的DNA損傷有多種不同的類型，歸結起來，可分為4種主要的類型：（1）堿基損傷，包括形成嘧啶二聚體、堿基共價化合物、堿基烷基化和堿基缺失、轉換、顛換；（2）糖基破壞；（3）DNA鏈交聯，包括DNA鏈內交聯、鏈間交聯和DNA蛋白質交聯；（4）鏈斷裂［11］，其中鏈斷裂中的單鏈斷裂（single strand break，SSB）是由于間接的DNA損傷所引起的。同時，單鏈斷裂也是由于DNA核糖損傷程度增加直接引起，以及受到內源性活性氧或過氧化氫、電離輻射攻擊而產生［12］，更嚴重的會引起雙鏈斷裂（double strand break，DSB）［13］。

2 DNA損傷檢測的方法及優缺點

近年來，研究者陸續建立了很多DNA損傷的檢測方法，如線粒體基因拷貝數［14］，限制性酶切片段長度多態性分析（restriction fragment length polymorphisms，RFLP）［15］及溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）［16］等。另外，還包括單細胞凝膠電泳試驗（彗星試驗，comet assay）［17］、堿解旋（alkaline unwinding）［18］和微核測定法（micronuclei test）［19］等。雖然這些方法各有特點，但DNA損傷研究對象都集中在基因組，不能對特定基因的損傷進行直觀或精確的定位定量檢測與分析。此外，這些方法對DNA損傷的程度也不能做到精確的定量。目前，雖有一些可用于特定基因檢測的方法，如單鏈構象多態性（single-strand conformation polymorphism，SSCP）［20］和8-氧基鳥嘌呤（8-oxoG）［21］的分析測定，但這些方法主要用于堿基突變或特定堿基損傷的檢測，而不能檢測基因的總體損傷情況。同時，這些方法都需要大量的DNA及引物，而8-oxoG雖然不需要引物，但經常需要和其他技術，如高效液相色譜-電化學法、酶聯免疫吸附法等結合使用［22］，工作量大且耗時較長。

3 PCR技術在DNA損傷研究中的應用

日本Higuchi等［23］于1992年首次采用動態PCR方法和封閉式檢測方法對目的核酸數量進行定量分析，提出熒光定量PCR技術的概念。1995年，美國Applied Biosystems公司成功研制了TaqMan技術，1996年又推出了首臺熒光定量PCR檢測系統。該系統通過在PCR反應體系中加入熒光染料，使之與雙鏈DNA結合從而收集熒光信號，利用收集的熒光信號再對整個PCR進程進行實時監測，并使用Ct值進行分析，通過做標準曲線對未知模板進行定量分析［24，25］。相較于常規PCR方法無法對起始模板準確定量且只能對終產物進行分析的局限性，實時定量PCR方法是目前確定樣品中DNA（cDNA）拷貝數最敏感、最準確的方法，具有自動化程度高、重現性好和無污染等特點，目前已經在分子生物學領域和醫學領域得到廣泛的使用。

常規Real-time QPCR技術應用于DNA損傷的研究雖早已有報道，但其通常需要與其他技術結合使用，并且操作步驟繁瑣，同時也增加了試驗過程中誤差形成的可能性。Neher等［26］通過單個線蟲暴露于苯并芘和熒蔥中，用提取的DNA先采用PCR技術擴增出ced-1基因16 144 bp和rpa-1 281 bp長度的片段，進而通過Real-time QPCR技術從擴增的ced-1基因中選擇109 bp的片段作為擴增的目的片段，rpa-1中選擇81 bp的片段作為擴增的參比片段，經苯并芘和熒蔥處理下的DNA會形成加合物，而加合物的存在會抑制DNA的擴增。將處理組目的片段和參比片段的比值與未處理組目的片段和參比片段的比值相比，當比值≤0.05時，表明有抑制了PCR反應的DNA加合物的存在。通過Real-time QPCR結合8-oxoG技術，孫玉等［27］采用亞甲藍聯合可見光（MBL）方法處理肝癌細胞株（HepG2），使得DNA鏈中鳥嘌呤被氧化成8-oxoG，而8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶（8-oxoguanine DNA glycosydase）可特異切割8-oxoG位點，與未經處理的DNA相比，經酶切后完整的DNA模板減少，再經Real-time QPCR法擴增時，表現為Ct值較大的現象，從而可以反推DNA中8-oxoG的含量，進而成功構建了DNA的氧化損傷模型。

Rothfuss等［28］利用Real-time QPCR分析神經母瘤細胞系SH-SY5Y經H2O2暴露后線粒體基因組不同位置DNA損傷情況，試驗過程中，選取線粒體ND5、ND1/ND2、COⅡ/ATPase6/8及D-Loop 4個位置，擴增其大小在1 kb左右的片段，根據mtDNA區域每10 kb DNA所包含對應長片段的長度計算出DNA的損傷，得出線粒體DNA損傷率與擴增片段的長度成反比的結論，并驗證了線粒體不同區域對損傷的敏感程度不同的說法。

Santons等［29］在研究哺乳動物細胞核DNA，線粒體DNA損傷及修復的過程中建立了一種長距離PCR的方法，該種方法檢測DNA損傷的原理是基于多種類型的DNA損傷都可以減緩或阻止DNA聚合酶的進程。其優點在于能直接從總DNA中直接檢測線粒體DNA的完整性而不用再單獨分離出線粒體DNA，并且能夠準確的檢測核DNA和線粒體DNA的損傷程度。之后，很多學者將該技術應用于人類疾病和模式生物DNA損傷的檢測。Jung等［30］用長距離定量PCR（LA-QPCR）方法檢測大西洋鳉魚線粒體DNA和核DNA損傷的情況，通過向相對未受污染的魚體內注射苯并芘，測定肝、腦、肌肉組織中DNA的損傷程度。同時，還檢測了受污染區域的大西洋鳉魚肝、肌肉DNA的損傷，認為長距離定量PCR技術為評估DNA損傷提供了靈敏的檢測手段。在研究人類疾病方面，長距離定量PCR技術也發揮了重要作用。用此方法，Van等［31］驗證了正常人類的成纖維細胞中轉錄的次黃嘌呤轉移酶基因比非轉錄的beta-球蛋白基因修復率更高的說法。而Fukagawa等［32］也采用長距離定量PCR的方法驗證了衰老和基因肥胖型會造成體內線粒體DNA缺失。此外，長距離定量PCR技術還可用于檢測人肺癌細胞系PLK3/PRK基因內含子及外顯子的結構和多態性分析［33］。

盡管LA-QPCR技術在DNA損傷檢測方面得到很多的應用，但該方法采用的是終點檢測法，對模板濃度和PCR循環數都有較高的要求，不能對PCR情況進行實時監測。近年來，一些學者考慮將實時定量PCR技術和長距離定量PCR技術結合。Vidal等［34］于2005年最早報道了LA-real time QPCR技術在檢測A型血友病凝血因子VIII基因22號內含子倒置試驗中的應用。該研究分別擴增了陽性個體，陰性個體及女性A型血友病攜帶者3個試驗組內含子區域12 kb及11 kb長度的片段，并根據Ct值的大小可以一步快速檢測A型血友病VIII基因突變的情況。Maruyama等［35］應用LA-real time QPCR技術擴增了4.1 kb、8.5 kb和15.5 kb的質粒片段，可以靈敏的檢測河流中胞外質粒的存在。Edwards［22］采用LA-real time QPCR技術成功擴增了15 kb 幾乎可以覆蓋整個線粒體基因組的長片段，可以快速，高重復性的檢測線粒體的DNA損傷。

4 長距離實時定量PCR技術

常規的Real-time QPCR，為了保證擴增效率，擴增目的片段的長度要求在50-300 bp之間，一般不會超過400 bp［36］。LA-QPCR能夠擴增的目的片段可達20 kb左右［37，38］，這就對PCR反應條件提出了很多的挑戰。經過多次探索并參考前人的研究結果，結合Real-time QPCR技術和LA-PCR技術，我們建立了一整套LA-real time QPCR的相關技術，現詳細介紹如下。

4.1 DNA模板

LA-real time QPCR擴增DNA的片段長度可以達到20 kb，這就要求所提取的DNA具有高度的完整性，生物體基因組DNA的鏈一般比較長，在提取DNA的過程中，由于用力過猛或試驗操作不當，很容易造成DNA鏈的斷裂。我們知道，在PCR擴增的過程中，引物分正向、反向同時從3'和5'端向中間擴增，如果DNA鏈發生斷裂，PCR擴增就會中斷，近而影響PCR的擴增效率。因此，在裂解組織塊的過程中，我們使用研磨棒研磨組織塊，加入細胞裂解液后水浴裂解細胞，而非使用均漿機對組織快速研磨，同時提取DNA時，動作要輕緩，加入試劑后盡量避免反復吹打。在整個LA-real time QPCR的過程中，模板質量很重要，因為模板長度較長，在利用瓊脂糖凝膠電泳檢測模板質量時，膠的濃度要控制在0.6%左右。目前市售的適合長片段DNA檢測的marker已有多種，例如，TaKaRa、天根生化科技公司等生產的λ-Hind Ⅲ digest DNA marker。

4.2 DNA聚合酶

TaKaRa公司研制的LA-Taq是應用LA-PCR原理研制的具有3'→5'核酸外切酶的活性（具有校對，Proof reading的活性）的耐熱性DNA聚合酶。無論是擴增短鏈DNA還是長鏈DNA，其效率都優于其他同類產品，尤其在擴增大于10 kb的DNA片段方面，其優勢更加明顯，而且保真性很強。在PCR進程中高溫加熱前抗Taq單克隆抗體與LA-Taq酶結合，抑制聚合酶的活性，從而抑制低溫條件下由引物的非特異性退火或引物二聚體引起的非特異性擴增，能更有效地減少PCR過程中的非特異性反應，增強PCR擴增的特異性，得到良好的PCR結果［39］。

4.3 熒光染料

在熒光定量PCR反應體系中，需要加入熒光報告基團以確定反應過程中擴增產物的量的變化。而常用的熒光染料包括SYBR Green Ⅰ，這是一種非飽和菁類熒光素，能夠特異的識別雙鏈DNA并結合在DNA雙鏈上［40］，是應用最廣泛的化學檢測物質，但這種結合也是非特異的，它能夠與任何的dsDNA（如引物二聚體等）結合，造成試驗的假陽性結果。另外，還會出現的另一個問題是它會抑制PCR的進程，優先結合G+C含量豐富的片段［41］，當擴增的片段較短時，SYBR Green Ⅰ對PCR反應的抑制作用影響不大，但當擴增片段的長度大于10 kb左右的情況下，SYBR Green Ⅰ的抑制作用將使PCR不能正常擴增。我們在試驗中采用了不同濃度的SYBR GreenⅠ都未能成功擴增出長度為14 092 bp的斑馬魚線粒體片段。

在本實驗室建立的LA-real time QPCR技術中所采用的熒光染料為SYTO-82。Gudnason等［41］的研究表明，SYTO-82不抑制PCR的進程，不會優先結合G+C含量豐富的片段，而且較高的工作濃度也不會影響解鏈溫度和Tm值。因此，在LA-real time QPCR 時使用SYTO-82作為熒光染料，得到了較好的擴增效率（E=1.696），且不同模板濃度下R2=0.994，說明擴增效率重現性很好，即使用SYTO-82作為熒光染料擴增片段長度為14 092 bp的片段仍可以得到良好的擴增效率。同時為了平衡PCR加樣誤差所引起的PCR管與管之間的差異，在PCR反應體系中加入ROX參考染料［42］。

4.4 引物

引物的選擇是PCR能否成功擴增的關鍵，一般來說，長片段引物的堿基數要比普通PCR反應所需的引物要長，一般為24±2個核苷酸，這樣能夠增加其與模板結合的穩定性；而且G+C含量也要控制在50%左右。決定PCR反應的另一個重要因素是引物的Tm值，因為擴增的片段比普通PCR反應較長，這就需要Tm值也比普通的較高，其范圍應該在68℃左右。與普通PCR的引物設計一樣，在設計長片段引物的過程中，也要考慮錯配和引物二聚體的問題，從而使引物的設計符合長片段PCR反應的要求［29］。

4.5 數據分析

在使用常規實時定量PCR技術研究基因表達的過程中，樣本間的誤差會干擾試驗數據，為了得到更精確的數據，通常需要一個或多個內參基因來消除起始樣本的誤差及反應效率的誤差。一般常選擇看家基因（housekeeping gene）作為內參［28、43，44］，LA-real time QPCR也需要相應的內參對DNA中某片段的初始濃度進行標準化，以消除樣品提取過程中產生的影響。首先選取長度約20 kb的DNA片段，設計引物，擴增出較長的片段，在擴增的長片段中選取200 bp左右長度的片段，設計引物擴增該片段，因選取的短片段與長片段在同一個序列中，相對于長片段，短片段受損傷的幾率很低，其拷貝數可以用來校準長片段的拷貝數。

常規的Real-time QPCR技術一般采用2-ΔΔCt的方法計算目的基因的相對表達量，該方法是建立在參比基因和目的基因的擴增效率都接近100%的基礎上的。但是，當擴增的片段較長時，無論怎么優化條件，其擴增效率不可能達到100%。Rothfuss等［28］根據Real-time QPCR建立起來的半長距離實時定量PCR（Semi-long real time PCR）技術雖然擴增的長度在1 kb左右，但1 kb的片段擴增效率在69.4%-89%之間，在分析數據時他們仍采用了2-ΔΔCt的計算方式，致使結果有很大的誤差。而本試驗在擴增斑馬魚線粒體長度為14 092 bp的片段時，計算得出的擴增效率為69.6%。因此，我們在數據分析時，采用ET

CtT（C）-CtT（S）/ERCtR（C）-CtR（S）的公式［45］，公式中ET、ER分別指長距離片段和短距離片段的擴增效率，CtT（C）-CtT（S）、 CtR（C）-CtR（S）分別指長距離片段和短距離片段介導的處理組和對照組DNA模板定量擴增得到的Ct值，數據分析考慮了不同片段的擴增效率，使結果更加準確。

5 結語

隨著人們對DNA損傷及其修復機制研究的不斷深入，對于DNA損傷檢測技術的要求也越來越高。LA-real time QPCR技術由于所需DNA量少，檢測靈敏度高等優點，盡管在區分不同類型和具體損傷位點方面有所欠缺，但就現有的試驗技術而言，LAreal time QPCR無疑為DNA損傷的檢測提供了更為方便快捷的技術手段。隨著技術的不斷進步，或與其他檢測方法的聯合應用，相信LA-real time QPCR在檢測環境污染物對生物體DNA損傷以及人類一些相關疾病的診斷方面將會得到越來越多的應用。

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