細胞生物學創新實驗設計——精子細胞學分析

侯 元， 霍德勝， 劉永茂

(吉林大學白求恩醫學院實驗教學中心，吉林長春130021)

0 引言

實驗教學是高等學校教學過程中的一個重要環節，是高等學校的生命線，也是培養學生實際操作能力的重要環節［1］。實驗教學方法有多種，如:基礎性實驗和驗證性實驗，設計性實驗，綜合性實驗和創新性實驗。基礎性實驗和驗證性實驗主要側重于對理論知識的理解和記憶，創新性實驗是與驗證性實驗相對應的，具有探索性和創造性的實驗，其出發點是充分發揮學生學習的積極性、主動性和創造性，激發學生對科學技術的興趣，培養學生的創新精神和實踐能力［2］。為此，我們結合臨床將科研成果轉化為實驗教學項目，開展了創新型實驗設計。

1 實驗設計的目的方法和意義

目前，男性因素在不孕不育癥病因中占很大比例，精液分析在診斷男性不育及輔助生殖方面有重要作用。精液分析主要包括精子形態、密度和活力［3］。

1.1 精子細胞形態學檢測

精子形態是評價男性生育力的一個重要參數，資料表明正常精子形態(strict criteria)是體外受精主要預測參數，被認為是衡量男性生育力的較好指標［4］。

實驗課上，教師首先提供給學生一種簡單的檢測方法，即瑞士-吉姆薩染色法:標本用生理鹽水洗滌3次，離心、涂片、晾干，用95%乙醇固定10 min，瑞士-吉姆薩染液染色30～60 s;加等量磷酸鹽染色5～8 min，流水沖洗后，置95%的乙醇中2～4 s，自然干燥后，用樹膠封片，結果顯示了精子的正常形態和異常形態。

通過實驗操作，不但掌握了細胞染色技術，同時對觀察到的各種細胞形態產生了極大的興趣，引發了他們的好奇心，引導他們進一步的思考。比如，這些千奇百怪的異常形態是由什么因素造成的，有沒有其他更好的檢查方法。同學們主動查閱各種資料尋找答案，最終發現:目前，精子形態分類標準不統一，各國執行的統一精子形態評價標準受到質疑。并且多數對精子形態的分析，是在經典光學顯微鏡的油鏡下觀察，主觀因素較大。一些參數無法檢測，亦不可能對大量樣本進行分析。現有報道用計算機輔助精液分析系統(CASA和ASMA)為精子形態、動態分析提供了便利，提高了實驗準確性和客觀性［5］。隨后，學生走出教室，走進臨床醫院生殖醫學中心，采用WLJY-9000型彩色精子形態檢查系統人工修正方法分析精子形態。操作過程中精液凃片用改良巴氏染色。形態按系統設定程序分為11類，即形態正常精子、大頭精子、小頭精子、梨形頭精子、錐形頭精子、無定形頭精子、空泡樣頭精子、雙頭精子、頸部和中段缺陷精子、尾部形態缺陷精子，和其他形態缺陷精子。為提高閱片準確性，同一份樣本由兩位檢測人員進行精子形態分析。這一社會實踐活動進一步激發了學生們科學研究的熱情。

1.2 精子活率與活力測定

精子的成活率對于生育也是至關重要的。精子活率測定方法采用伊紅-Y染色法，即取精子標本用伊紅Y染色，裝片，鏡檢，死精子呈紅色，活精子不著色。計數200個精子，計算得出活精子百分數。

此實驗在使學生掌握了細胞制片技術和顯微鏡使用方法的同時，進一步了解精子運動特征對生育能力的影響。

Hirano等認為，評估精子運動速度是預測受精率的有利參數。本實驗采用國產WLJY-9000型偉力彩色精子質量檢測系統，進行精子活力分析。測定參數主要包括，精子曲線速度(VCL)、直線速度(VSL)、平均路徑速度(VAP)、直線性(LN)、前向性(STR)、擺動性(WOB)、頭部側擺幅度(ALH)、鞭打頻率(BCF)、平均移動角度(MAD)。通過這個實驗，引發學生深入思考，如精子的活力受哪些因素影響，精子的運動速度與精子形態有何關系，造成精子死亡因素有哪些。

帶著一大堆的疑問學生們走進了圖書館。他們孜孜不倦的查閱文獻資料，真正理解了細胞是生物體結構與功能的基本單位這個定義的內涵［6］。構成人體或其他高等動物體的細胞種類繁多、形態各異，這些細胞的形態與其功能往往相適應。善于運動的精子是由于它長了一根長長的鞭毛［7］。Katz等［8］認為精子頭部幾何形態異常是導致精子運動異常的主要原因。由于研究手段不同，也有不同結果報道，認為精子頭部畸形引起其流體力學特性改變導致的運動性改變、尾部受損引起運動方式改變的可能性很小。一些外界因素共同作用于精子形態和動態，引起兩者同時改變是導致精子形態和動態異常相伴產生的主要原因［5］。

學生們在教師的指導下繼續探索，對這些問題有了進一步認識:精子DNA與體細胞結構不同。精子DNA損傷是造成精子畸形和運動速度、方向改變的根源。精子DNA損傷會影響受精、受精卵分裂和胚胎發育，最后導致不孕不育、流產死胎、胎兒、嬰兒發育異常。造成精子損傷的因素很多，如藥物、放射線、高溫、生殖道炎癥、環境毒素、高齡和生活方式［9］。有報道，吸煙者的精子DNA斷裂顯著增高，吸煙對精子核質量是有害的。精子DNA損傷發生率與精子密度、活動力、形態等參數有高度的負相關性。吸煙導致弱精子癥和畸精子癥，輕度吸煙對精子活力有影響，重度吸煙對精子形態有影響。吸煙男性的精子密度和形態低于不吸煙者，且吸煙對精子參數的影響有劑量依賴性［10］。長期大量吸煙對精子凋亡有明顯影響［11］。原因是:香煙煙霧中的誘變物質，不僅可以造成體細胞遺傳物質的損傷，還可以通過血-生殖腺屏障對生殖細胞或精子的發育造成影響。導致精子DNA斷裂增加，精子畸形增多［12］。慢性酒精中毒能使正常形態精子數下降。原因是:慢性酒精中毒引起維生素A和鋅的缺乏，進而精子上皮細胞發育不良，導致少精子癥和無精子癥［13］。桑拿浴或經常用溫度較高的水淋浴及在桑拿房停留的時間過久，可導致精子生成減少，或出現死精子［14］。因為探討的內容與日常生活密切相關，引發了學生的好奇心，調動了學習的積極性。

1.3 白細胞檢測

檢測精液中白細胞是否存在，是尋找不孕不育癥病因手段之一。本實驗聯苯胺染色法:取精子細胞標本1滴，加入1滴聯苯胺染液，混勻，于37℃放置20 min，鏡檢，白細胞染成褐色，其他細胞染成品紅色。采用聯苯胺染色方法，依據白細胞內源性過氧化物酶，而使過氧化物酶陽性白細胞染成棕色。在有過氧化氫存在時MPO分解H2O2，產生新生態氧，將聯苯胺氧化成帶酯式結構的有色化合物。此方法涉及了生物化學中酶和底物特異性結合的理論知識與無機化學中的氧化還原反應等知識點。

為什么有的樣本中存在白細胞?這對精子的形態、活力和活率有何影響，其發生機制如何?學生們經過深入探討得知:因為有炎癥反應，才使白細胞增多。精子中增多的白細胞可以刺激人類精子產生活性氧(Reactive Orygen Species，ROS)，這種刺激可以通過細胞-細胞接觸或白細胞產生的可溶性產物等多種途徑介導。25%～40%的不育男性精液中存在高水平的ROS［9］。當過量ROS超過了抗氧化系統的清除能力和防御能力時，則導致精子DNA雙鏈斷裂，產生單鏈。且由于精子細胞膜中含有大量不飽和脂肪酸，因此理論上精子極易受到ROS的損害。精子DNA被破壞后，精子的形態、活力和活率也就發生了相應的變化。

1.4 精子冷凍與復蘇

精子的細胞學分析實驗，對標本的活性要求很高。因此掌握精子的凍存與復蘇技術是非常必要的。

(1)冷凍。將精液與保護劑1∶1混勻后，裝入布袋，放在液氮液面上20 cm處冷凍20 min，再浸入液氮。

(2)復蘇。將凍存的標本從液氮中取出后直接放入37℃水浴中5 min即可。

這個實驗讓學生親眼看到細胞經超低溫冷凍后，仍能恢復原始狀態。

2 儀器設備及試劑

(1)儀器。自動平衡離心機、液氮罐、恒溫水浴、恒溫培養箱、WLJY-9000型偉力彩色精子質量檢測系統。

(2)試劑。伊紅Y、聯苯胺、甲醇、玫瑰紅、雙氧水、瑞氏染液、吉姆薩染液、乙醇、甘油等。

3 結果與討論

本實驗設計由觀察精子的形態入手，進而分析了精子的活力與活率，以及引起它們發生改變的各種外界因素。挖掘了男性不育癥的根源。通過對患者精子活力檢查、精子細胞形態學檢查、白細胞的檢查;學生掌握了精子細胞的形態學的檢測方法，熟悉了顯微鏡和離心機等簡單設備的使用方法，了解了自動化儀器的檢測方法。通過精子的冷凍與復蘇，掌握了細胞保存的原理和方法。

本實驗設計始終堅持基礎與臨床相結合的原則，使學生對探索醫學科學的奧秘產生了濃厚的興趣。增強了學生學習的主動性與自覺性，實驗收到了良好的教學效果。

4 結語

精子細胞學分析這一創新實驗體系，通過五屆臨床醫學七年制和六屆臨床醫學五年制的教學實踐證明，其方法具有創新性、針對性、實用性和可行性。由于它來自臨床科研成果的轉化，與臨床檢驗關系密切。因此能極大地調動學生學習的積極性，引發學習興趣。培養學生的科研意識和創新思維。提高學生綜合運用知識，分析問題解決問題的能力［15］。從而使學生站在科學領域的前沿來了解科學發展的動態。以便盡快地適應社會發展的需要。

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