蛋源性抗菌肽的研究進展

王俊杰，趙 燕,*，涂勇剛，羅序英，李建科，楊有仙，鄧文輝

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學 生物質轉化教育部工程研究中心，江西 南昌 330047；3.江西農業大學食品科學與工程學院，江西 南昌 330045)

抗菌肽(antimicrobial peptides)是一類小分子多肽，通常帶有正電荷，其分子一般由12～100個氨基酸組成，分子質量小于10kD[1]。抗菌肽是生物體天然免疫系統的重要組成部分，大部分生物利用自身的抗菌肽作為抵御微生物入侵的第一道防線[2-3]。到目前為止，人們已從鳥類、昆蟲、植物、動物以及人體內發現多種抗菌肽，并已有大約1500多種抗菌肽被分離出來[4]。

因抗菌肽具有熱穩定性高、抗菌譜廣等優點，從食物蛋白中獲得抗菌肽成為生物領域的研究熱點之一[5-6]，而富含蛋白質的禽蛋自然成為分離天然或制備抗菌肽的研究對象。禽蛋蛋白質經過酶解后，可以得到一些抗菌活性的小分子多肽，這些抗菌肽具有分子質量小、易吸收等優點，可將其作為抗生素類藥物的替代品以及功能性食品的成分[7]。本文主要綜述蛋源性抗菌肽的來源、抗菌活性的構效關系，提出蛋源性抗菌肽研究中存在的問題，以期為蛋源性抗菌肽以及其他抗菌肽的相關研究提供一定的參考。

1 禽蛋蛋白質

禽蛋是一種世界各地區最為普遍食用的食品之一，其營養豐富，蛋白質易消化吸收，富含人體所有必需氨基酸，并且氨基酸組成非常接近人體所需的必需氨基酸比例[8]。禽蛋中蛋白質不但含量豐富，而且種類繁多。已經證實禽蛋中含有數百種蛋白質，現鑒定出結構不同的蛋白質有40余種[9-10]，大量研究表明禽蛋類蛋白和多肽不僅為人類提供基本的營養需求，而且還具有多種生物效應，如抗菌活性、免疫調節作用、抗癌和抗高血壓活性。這些生物活性表明禽蛋蛋白在人類健康、疾病的預防和治療中有重要作用[11]，這為蛋源性抗菌肽的制備提供了豐富的物質基礎。

2 蛋源性抗菌肽

目前，人們已從禽蛋中獲得多種抗菌肽，主要來源于卵白蛋白、卵轉鐵蛋白、卵黏蛋白、溶菌酶、蛋黃蛋白質。這些抗菌肽具有分子質量小、生物活性強、易吸收等優點，而且這些蛋源性肽比化學合成的更安全、更健康[12]。

2.1 卵白蛋白源抗菌肽

卵白蛋白是一種糖蛋白，在禽蛋蛋清約占54%，分子質量45kD，等電點4.7，通過電泳可將其分離成3種不同含磷量的亞基[13]，卵白蛋白與絲氨酸蛋白酶抑制劑家族有大約30%的序列同源性[14]，人們對其進行了深入的研究，但仍不能揭示其生物功能[15]。經過胰蛋白酶和糜蛋白酶水解卵白蛋白獲得的肽片段具有抗細菌、真菌活性和免疫刺激活性，這些水解片段用于發酵食品中能夠抑制細菌的增值[16-18]。

Pellegrini 等[18]報道卵白蛋白通過胰蛋白酶在37℃條件下水解處理6h，水解液經分離純化得到5個抗菌肽，測得其序列分別是SALAM(殘基36～40)、SALAMVY(殘基36～42)、YPILPEYLQ(殘基111～119)、ELINSW(殘基143～148)、NVLOPSS(殘基159～165)。此外，用胰凝乳蛋白酶將卵白蛋白在37℃條件下水解處理6h，經分離純化得到3個抗菌肽，其序列分別為AEERYPILPEYL(殘基127～138)、GIIRN(殘基155～159)、TSSNVMEER(殘基268～276)，用化學方法合成這些抗菌肽分析其抑菌活性，發現其對枯草芽孢桿菌具有很強的抑制性，對大腸桿菌、支氣管炎博德特菌、綠膿假單胞菌和黏質沙雷氏菌有一定強度的抑制性。在這8種抗菌肽中，TSSNVMEER和GIIRN對測試菌的殺菌活性最強，而SALAM的殺菌活性最弱，但GIIRN對所有的G―的活性均較弱。此外，將這些抗菌肽與其他絲氨酸蛋白酶抑制劑進行序列同源性分析，發現這些抗菌肽分子中的抗菌序列與其他絲氨酸蛋白酶抑制劑沒有序列同源性。這些結果表明哺乳動物胃腸道中的蛋白酶能將卵白蛋白酶解得到抗菌肽類物質，在為機體提供營養的同時，還增強了機體的免疫防御功能。

2.2 卵轉鐵蛋白源抗菌肽

禽蛋中的卵轉鐵蛋白屬于轉鐵蛋白家族，在蛋清中約占12%，卵轉鐵蛋白有686個氨基酸，分子質量77.90kD，等電點6.38，其與人的血清轉鐵蛋白有51%的同源性，與人類和牛科乳鐵蛋白有49%的同源性，在C末端區域有最顯著的同源性[19]。卵轉鐵蛋白對蛋清中革蘭氏陰性腐敗微生物的抑制起著重要作用[20]。

Ibrahim等[21]在天冬酰胺殘基處采用特定裂解的方式從卵轉鐵蛋白中鑒別出1種抗菌肽，命名為OTAP-92，Pellegrini[22]通過胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解卵轉鐵蛋白，在水解液中也分離純化出這種抗菌肽。OTAP-92是雞蛋中卵轉鐵蛋白(OTf)N末端的第109～200位氨基酸序列片段，包含6個半胱氨基酸，形成3個分子內二硫鍵，起到維持OTAP-92三級結構的作用[21-22]。OTAP-92具有比卵轉鐵蛋白更廣的抗菌廣譜性，除了能夠抗金黃色葡萄球菌和大腸桿菌k-12[23]，還有報道[24-26]稱這種肽具有抗芽孢桿菌和腸炎沙門氏菌以及抗病毒活性，但它不具有結合金屬離子的能力[21]。Ibrahim等[23]證實了OTAP-92引起大腸桿菌外膜以劑量依賴性的方式滲透到1-N-苯基萘胺熒光探針上，這一結論表明OTAP-92是以自我促進吸收的方式穿越細菌的外膜，在細胞質膜上形成小孔和離子通道，破壞細胞質膜的生物功能，進而起到殺死細菌的作用。Giansanti等[27]從雞卵轉鐵蛋白中分離得2個多肽片段DQKDEYELL(hOtrf219～227)和KDLLFK，且KDLLFK在雞卵轉鐵蛋白中重復出現2次，分別對應于N末端的hOtrf296～301和C末端的hOtrf633～638，二者與2個牛科乳鐵蛋白片段ADRDQYELL(bLf222～230)和EDLIWK(bLf264～269)具有序列同源性，這2個牛科乳鐵蛋白片段對單純性皰疹病毒有抑制活性。用化學方法合成這2個片段，發現其能防止雞胚肽纖維母細胞被馬立克病毒感染，利用NMR分析這2種化學合成的肽，它們在溶液中沒有產生任何新的構象。這表明這2種肽在卵轉鐵蛋白中所呈現的氨基酸序列和構象對其抗病毒活性中具有重要作用。

2.3 卵黏蛋白源抗菌肽

卵黏蛋白僅占蛋清蛋白的3.5%，但在蛋清凝膠性質中起主要作用。據報道卵黏蛋白由1個含少量糖類的亞基(α-亞基，220kD，10%～15%的糖)和1個富含糖類的亞基(β-亞基，400kD，50%～65%的糖)組成[28]。由卵黏蛋白獲得的抗菌肽對細菌和病毒都有抑制作用[29-31]。

Kobayashi等[29]用鏈霉蛋白酶處理母雞卵黏蛋白，獲得卵黏蛋白糖肽(OGP)，它能與大腸桿菌(E. coli O157：H7)特異性結合，過碘酸鹽處理OGP，二者結合能力明顯下降，說明E. coli O157：H7結合于OGP的糖配基上。OGP經蛋白印跡分析，發現二者的結合部位類似于E. coli O157：H7生物素探針與E. coli O157：H7的結合部位，用唾液酸酶處理過的OGP，完全失去與E. coli O157：H7結合的能力，表明唾液酸在二者結合中起著重要作用，進而說明OGP中含有唾液酸的部位能與E. coli O157：H7產生特異性結合，起到抑制大腸桿菌生長的作用。此外，在食品衛生學領域，OGP還可以用于開發檢測E. coli O157：H7的新型探針[29]。Tsuge等[30]通過體外實驗已經證實由鏈霉蛋白酶處理卵黏蛋白得到的抗菌肽對新城雞瘟病毒、牛輪狀病毒和人流感病毒均有抑制活性。抗菌肽對病毒的抑制作用主要是影響病毒增殖和病毒基因的表達，有的也具有直接殺傷作用[30-31]。

2.4 溶菌酶源抗菌肽

溶菌酶(lysozyme)又稱胞壁質酶，它廣泛存在于鳥類、家禽的蛋清中和哺乳動物的淚液、唾液、血漿、乳汁、胎盤以及體液、組織細胞內，其中在蛋清中含量最豐富，約占蛋清蛋白的3.5%，分子質量14.307kD，等電點10.7，包含129個氨基酸殘基[32]，這些殘基通過4個二硫鍵相互交聯。溶菌酶抗菌活性與對細菌肽聚糖細胞壁上的N-乙酰氨基胞壁酸的C-1和N-乙酰氨基葡萄糖的C-4糖苷鍵的分裂活性有關，其對細菌的N-乙酰胞壁酸(NAM)和N-乙酰氨基葡糖(NAG)的β-1,4糖苷鍵分裂活性越強，抗菌活性就越高[20,33]。從溶菌酶中酶解后得到的抗菌多肽具有抗G+、G―的活性，阻止DNA、RNA的合成，抑制細胞的呼吸，同時還可以作為天然防腐劑，抑制芽孢桿菌生長的作用[34-41]。

Pellegrini等[37]采用梭菌蛋白酶分段酶解溶菌酶得到1個具有抗菌活性而沒有溶菌酶活性的15肽，它的氨基酸序列是Ile-Val-Ser-Asp-Gly-Asp-Gly-Met-Asn-Ala-Trp-Val-Ala-Trp-Arg，對應與溶菌酶的第98～112位氨基酸，這一序列被認為是螺旋-環-螺旋域的一部分(87～114殘基)，位于溶菌酶活性中心裂的上唇部位，用化學方法合成這種肽分析其抑菌活性，發現它對G+、G―以及白色念球菌都有抑制作用[38]。經化學修飾后檢測其抑菌性發現，序列中第108、111位的Trp殘基在其抗菌活性中有著重要作用。Mine等[39]利用胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解蛋清溶菌酶得到2個抗菌肽，其中1個的序列為Lle-Val-Ser-Asp-Gly-Asp-Gly-Met-Asn-Ala-Trp，對應于溶菌酶氨基酸序列的98～108位，位于溶菌酶螺旋-環-螺旋結構的中部，能夠抑制G―大腸桿菌k-12；另1個新性抗菌肽序列為His-Gly-Leu-Asp-Asn-Tyr-Arg-Gly，對應于溶菌酶氨基酸序列的15～21位，能夠抑制金黃色葡萄球菌。當這2種肽的質量濃度達到400μg/mL時，15h后細菌的細胞膜被破壞，他們認為可能是因為這2種抗菌肽在細菌細胞壁上絮集形成螺旋通道，通過C末端螺旋進入細菌細胞內，與細胞內的生物大分子結合，進而起到抑制細菌的生長。Thammasirirak等[40]用蛋白酶消化鵝型溶菌酶，經過反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化、液相色譜-串聯質譜(LC/MS-MS)、Edman化學降解確定該抗菌肽的序列Thr-Ala-Lys-Pro-Glu-Gly-Leu-Ser-Tyr，這個序列位于鵝型溶菌酶N末端外圍部分的第20～28位，經化學合成分析，發現該肽對G+、G―均有抗菌性，但不具有溶菌酶的活性，通過電子掃描顯微鏡發現這種抗菌肽作用于細菌細胞膜上，他們認為該抗菌肽的作用機理可能是其α-螺旋結構可橫穿細胞膜，破壞細菌膜結構。序列中的Pro可能在抗菌活性中也有重要作用，因為當該肽與細菌外膜相互作用時，Pro殘基可能有利于促進α-螺旋結構的形成。Memarpoor-Yazdi等[41]利用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶以及二者的混合物水解雞蛋溶酶菌，發現采用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶混合水解雞蛋溶菌酶得到的水解產物比其他酶水解得到的產物活性要高，采用RP-HPLC分離純化得到活性片段，并命名為F2片段，利用串聯質譜分析法鑒定其序列為NTDGSTDYGILQINSR，該序列對應于溶菌酶的46～61位，分子質量為(1753.98±0.5)D。利用徑向擴散分析法(RDA)分析其活性，結果表明F2片段對G+、G―均有抑制效果，F2片段對大腸桿菌和腸膜狀明串菌株的最小抑菌溶度(MIC)值分別為355.642.2、442.252.8g/mL。F2片段的C末端含有Arg，其在抑菌作用中起著重要作用，這可能是因為F2片段的免疫決定簇是在與Arg殘基有關的部位，或者可能就是Arg殘基本身，能夠與細菌細胞內的生物大分子結合，進而抑制其生長[42]。

2.5 蛋黃源抗菌肽

蛋黃中的蛋白質的生化功能幾乎和蛋白中蛋白質一樣，其中多數為磷蛋白和脂肪結合而形成的脂蛋白，包括低密度脂蛋白(65.0%)、卵黃球蛋白(10.0%)、卵黃高磷蛋白(4.0%)和高密度脂蛋白(16.0%)等。

Sugita-Konishi等[43]從蛋黃蛋白質中獲得唾液酸糖肽，給被沙門氏菌感染的小鼠口服該肽，能夠有效抑制小鼠脾臟中的細菌增殖，同時還能降低致死率。通過給小鼠口服帶有放射性的唾液酸糖肽，發現該化合物通過腸道吸收進入血液，8h內通過尿液排出。當連續服用唾液酸糖肽能夠有效抑制沙門氏菌的感染，這種抑制作用是通過內臟抑制細菌的入侵實現的。Herve-Grepinet等[44]采用親和色譜柱和反相色譜柱提純方法從原雞母雞的卵黃膜中分離出鳥類β-防御素11，是一種小分子非糖基化陽離子肽，分子質量為(9271.56±0.12)D，含有82個氨基酸，序列為LPRDTSRCVGYHGYCIRSKVCPKPFAAFGTCSW RQKTCCVDTTSDFHTCQDKGGHCVSPKIRCLEEQLGLCPLKRWTCCKEI，采用徑向擴散的方法檢測出AvBD11對金黃色葡萄球菌(ATCC 29740)和單核細胞增多性李斯特氏菌(EGD)的最小抑菌濃度分別為0.33、0.28μmol/L。AvBD11對腸炎沙門菌ATCC 13076、腸炎沙門菌LA5、鼠傷寒沙門菌 ATCC 14028和大腸桿菌ATCC 25922的最小抑菌濃度分別為0.31、0.15、0.25、0.37μmol/L。他們認為AvBD11抗菌活性與其所帶的陽離子和氨基酸有關。

3 蛋源性抗菌肽的構效關系

抗菌肽的活性由分子結構決定，研究表明影響抗菌肽生物活性因素與其所帶的正電荷數、水脂兩親結構、氨基酸序列等有關。研究天然抗菌肽的構效關系，有利于定向設計合成或表達新型抗菌肽分子，開發活性更高、抗菌譜更廣的抗菌類物質[45]。

Powers等[46]證明了陽離子電荷和疏水兩親結構是抗菌肽抗菌活性的必要條件。帶正電荷的抗菌肽能夠抑制革蘭氏陰性菌的生長，這是因為在革蘭氏陰性菌的細胞膜上的脂多糖帶有負電荷，抗菌肽的正電荷能夠與其靜電結合，促進低濃度的抗菌肽在細胞膜上富集，進而起到抑制細菌的作用[47-48]。疏水作用對其活性的影響是通過改變肽鏈中Leu、Ile、Val 數量實現的，由于疏水基團的存在，肽鏈在溶液中可以通過疏水作用形成多聚體，增加了對真核細胞膜的親和力；同時也增加了抗菌肽形成兩性α螺旋的能力，而α螺旋的增加也提高了抗菌肽的穩定性[49]。

但抗菌肽所帶的正電荷和疏水作用并不總與其抗菌活性成絕對正相關性，Pellegrini等[18]通過研究從雞的卵白蛋白中提取的8種抗菌肽發現，序列為TSSNVMEER 和 SALAMVY的抗菌肽雖然帶有負電荷，但其抗菌活性和廣譜性都比唯一1個帶有正電荷的GIIRN要強。TSSNVMEER和AEERYPILPEYL在這8種抗菌肽中疏水性均是最弱之一，但二者的抗菌活性卻是最強之一，并且TSSNVMEER具有最廣的抗菌廣譜性。Herve-Grepine等[44]發現從蛋中提取的β-防御素11(AvBD11)和β-防御素10 3b(AvBD10 3b)分別帶有9和10個正電荷，但是二者對李斯特菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門菌和大腸桿菌有相似抑菌活性，這表明這2個抗菌肽的抗菌活性并不與其所帶正電荷呈線性關系。這些蛋源性抗菌肽的發現對現有的抗菌肽的活性模型提出了挑戰，說明從蛋源中獲得的抗菌肽的作用模型并不總能用已有的作用模型來解釋，需要人們進一步去探討其作用機理。

蛋源中抗菌肽的作用活性與氨基酸序列也有一定的關系，Pellegrini等[37]從雞的溶菌酶中提取出1個抗菌肽，其序列為Ile-Val-Ser-Asp-Gly-Asp-Gly-Met-Asn-Ala-Trp-Val-Ala-Trp-Arg，用化學方法合成這種抗菌肽，發現其與天然抗菌肽有相同的殺菌活性，當用酪氨酸取代第108位的色氨酸，其抗菌活性明顯降低；用酪氨酸取代第111位色氨酸，其抗菌活性完全失去；用精氨酸取代第106位天冬酰胺，增強了其抗菌活性，這說明色氨酸和精氨酸在這種抗菌肽的抗菌活性起著重要作用。由N末端的8個氨基酸序列(I-V-S-D-G-N-G-M)組成的多肽沒有抗菌性，而由C末端(N-A-W-V-A-W-R)組成的多肽具有形同的抗菌性，這表明序列N-A-W-V-A-W-R在抗菌活性中起著主要的作用。

4 蛋源性抗菌肽研究存在的問題與展望

雖然蛋源性抗菌肽具有諸多優點，但要實現商業化應用還需解決一系列研究中存在的問題：1)蛋源性抗菌物質的篩選問題，目前多采酶解分離純化后，采用抑菌實驗篩選抗菌物質，這種方法費時且靈敏性低，因此，尋找快速、靈敏、高通量的篩選抗菌物質的方法是下一步工作的努力方向。2)抗菌肽的制備問題，蛋白質酶解是制備蛋源性抗菌肽主要方法，酶解方法的關鍵問題是如何對肽鍵進行定向酶解，也就是如何實現酶切點的暴露與隱藏。目前多數利用亞基解離技術、變性技術、接枝技術以及多酶耦聯控制酶解技術等對原料蛋白進行預處理，實現對蛋白質的控制酶解。但是酶解方法存在操作復雜、純化成本高、產品率低等缺點。3)抗菌肽的作用機理與安全問題，雖然人們提出了幾種抗菌機理模型，但蛋源中抗菌肽的抑菌機理尚不能統一定論，并且一些對人體有益的抗菌肽物質是基于體外模型或者有限的臨床實驗，還需要做進一步的深入研究。

禽蛋是一種大宗食品，為人類提供了豐富的營養物質。此外，禽蛋中種類豐富的蛋白質為抗菌肽提供了一個良好的來源。從禽蛋蛋白質中酶解獲得的小分子抗菌肽類物質，具有高效、低毒、易吸收等特點。隨著生物學技術的發展，特別是蛋白質工程和酶工程技術的廣泛應用，人們將會從禽蛋中揭示更多的抗菌活性肽，為替代市場上產生耐藥性的抗生素類藥物的開發提供思路和方向，同時抗菌肽類制品還可以作為天然防腐劑廣泛應用于食品行業，對提高禽蛋的深加工、增加附加值也將會有重大的意義。

[1] HANCOCK R E. Peptide antibiotics[J]. Lancet, 1997, 349： 418-422.

[2] HANCOCK R E, LEHRER R. Cationic peptides： a new source of antibiotics[J]. Trends Biotechnol, 1998, 16(2)： 82-88.

[3] WANG Z, WANG G. APD： the antimicrobial peptide database[J]. Nucleic Acids Res, 2004, 32： 590-592.

[4] BULET P, STOCKLIN R. Insect antimicrobial peptides： structures, properties and gene regulation[J]. Protein Pept Lett, 2005, 12(1)： 3-11.

[5] PELLEGRINI A. Antimicrobial peptides from food proteins[J]. Curr Pharm Des, 2003, 9(16)： 1225-1238.

[6] WAKABAYASHI H, TAKASE M, TOMITA M. Lactoferricin derived from milk protein lactoferrin[J]. Curr Pharm Des, 2003, 9(16)： 1277-1287.

[7] MINE Y. Bioactive proteins and peptides as functional foods and nutraceuticals[M]. New York： Wiley-Blackwell Publishing, 2010： 247-263.

[8] MANN J, TRUSWELL A S. Essentials of human nutrition[M]. 4th ed. New York： Oxford University Press, 2012.

[9] FARINAZZO A, RESTUCCIA U, BACHI A, et al. Chicken egg yolk cytoplasmic proteome, mined via combinatorial peptide ligand libraries[J]. Journal of Chromatography A, 2009, 1216(8)： 1241-1252.

[10] D’AMBROSIO C, ARENA S, SCALONI A, et al. Exploring the chicken egg white proteome with combinatorial peptide ligand libraries[J]. Journal of Proteome Research, 2008, 7(8)： 3461-3474.

[11] MINE Y, KOVACS-NOLAN J. New insights in biologically active proteins and peptides derived from hen egg[J]. World’s Poultry Science Journal, 2006, 62(1)： 87-96

[12] SARMADI B H, ISMAIL A. Antioxidative peptides from food proteins： a review[J]. Peptides, 2010, 31(10)： 1949-1956.

[13] STEVENS L. Egg white proteins[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B： Comparative Biochemistry, 1991, 100(1)： 1-9.

[14] HUNTINGTON J A, STEIN P E. Structure and properties of ovalbumin[J]. Journal of Chromatography B： Biomedical Sciences and Applications, 2001, 756(1/2)： 189-198.

[15] IBRAHIM H. Insights into the structure-function relationship of ovalbumin, ovotransferrin and lysozyme[M]. New York： CRC Press, 1997.

[16] MINE Y, D’SILVA I. Egg bioscience and biotechnology[M]. New Jersey： John Wiley & Sons Inc, 2008： 141-184.

[17] BIZIULEVICIUS G A, KISLUKHINA O V, KAZLAUSKAITE J, et al. Food-protein enzymatic hydrolysates possess both antimicrobial and immunostimulatory activities： a “cause and effect” theory of bifunctionality[J]. FEMS Immunol Med Microbiol, 2006, 46(1)： 131-138.

[18] PELLEGRINI A, HULSMEIER A J, HUNZIKER P, et al. Proteolytic fragments of ovalbumin display antimicrobial activity[J]. Biochim Biophys Acta, 2004, 1672(2)： 76-85.

[19] WU J, ACERO-LOPEZ A. Ovotransferrin： structure, bioactivities, and preparation[J]. Food Research International, 2012, 46(2)： 480-487.

[20] HUOPALAHTI R. Bioactive egg compounds[M]. Heidleberg： Berlin Springer Verlag, 2007： 191-198.

[21] IBRAHIM H R, IWAMORI E, SUGIMOTO Y, et al. Identifi cation of a distinct antibacterial domain within the N-lobe of ovotransferrin[J]. Biochim Biophys Acta, 1998, 1401(3)： 289-303.

[22] PELLEGRINI A. Antimicrobial peptides from food proteins[J]. Current Pharmaceutical Design, 2003, 9(16)： 1225-1238.

[23] IBRAHIM H R, SUGIMOTO Y, AOKI T. Ovotransferrin antimicrobial peptide (OTAP-92) kills bacteria through a membrane damage mechanism[J]. Biochim Biophys Acta, 2000, 1523(2/3)： 196-205.

[24] ABDALLAH F B, CHAHINE J M. Transferrins, the mechanism of iron release by ovotransferrin[J]. Eur J Biochem, 1999, 263(3)： 912-920.

[25] BARON F, COCHET M F, PELLERIN J L, et al. Development of a PCR test to differentiate between Staphylococcus aureus and Staphylococcus intermedius[J]. J Food Prot, 2004, 67(10)： 2302-2305.

[26] GIANSANTI F, ROSSI P, MASSUCCI M T, et al. Antiviral activity of ovotransferrin discloses an evolutionary strategy for the defensive activities of lactoferrin[J]. Biochemistry and Cell Biology, 2002, 80(1)： 125-130.

[27] GIANSANTI F, MASSUCCI M T, GIARDI M F, et al. Antiviral activity of ovotransferrin derived peptides[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 331(1)： 69-73.

[28] HARISH PRASHANTH K V, THARANATHAN R N. Chitin/chitosan： modifi cations and their unlimited application potential： an overview[J]. Trends in Food Science & Technology, 2007, 18(3)： 117-131.

[29] KOBAYASHI K, HATTORI M, HARA-KUDO Y, et al. Glycopeptide derived from hen egg ovomucin has the ability to bind enterohemorrhagic Escherichia coli O157：H7[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52(18)： 5740-5746.

[30] TSUGE Y, SHIMOYAMADA M, WATANABE K. Differences in hemagglutination inhibition activity against bovine rotavirus and hen Newcastle disease virus based on the subunits in hen egg white ovomucin[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 1996, 60(9)： 1505-1506.

[31] TSUGE Y, SHIMOYAMADA M, WATANABE K. Structural features of Newcastle disease virus-and anti-ovomucin antibodybinding glycopeptides from pronase-treated ovomucin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1997, 45(7)： 2393-2398.

[32] CHARTER E A, LAGARDE G. Natural antimicrobial systems： lysozyme and other proteins in eggs[M]. RICHARD K R. Encyclopedia of food microbiology. Oxford： Academic Press Elsevier, 1999： 1582-1587.

[33] YOSHINORI M. Recent advances in the understanding of egg white protein functionality[J]. Trends in Food Science & Technology, 1995, 6(7)： 225-232.

[34] PELLEGRINI A, THOMAS U, WILD P, et al. Effect of lysozyme or modified lysozyme fragments on DNA and RNA synthesis and membrane permeability of Escherichia coli[J]. Microbiological Research, 2000, 155(2)： 69-77.

[35] IBRAHIM H R, INAZAKI D, ABDOU A, et al. Processing of lysozyme at distinct loops by pepsin： a novel action for generating multiple antimicrobial peptide motifs in the newborn stomach[J]. Biochim Biophys Acta, 2005, 1726(1)： 102-114.

[36] ABDOU A M, HIGASHIGUCHI S, ABOUELEININ A M, et al. Antimicrobial peptides derived from hen egg lysozyme with inhibitory effect against Bacillus species[J]. Food Control, 2007, 18(2)： 173-178.

[37] PELLEGRINI A, THOMAS U, BRAMAZ N, et al. Identifi cation and isolation of a bactericidal domain in chicken egg white lysozyme[J]. J Appl Microbiol, 1997, 82(3)： 372-378.

[38] IBRAHIM H R, THOMAS U, PELLEGRINI A. A helix-loop-helix peptide at the upper lip of the active site cleft of lysozyme confers potent antimicrobial activity with membrane permeabilization action[J]. J Biol Chem, 2001, 276(47)： 43767-43774.

[39] MINE Y, MA F, LAURIAU S. Antimicrobial peptides released by enzymatic hydrolysis of hen egg white lysozyme[J]. J Agric Food Chem, 2004, 52(5)： 1088-1094.

[40] THAMMASIRIRAK S, PUKCOTHANUNG Y, PREECHARRAM S, et al. Antimicrobial peptides derived from goose egg white lysozyme[J]. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol, 2010, 151(1)： 84-91.

[41] MEMARPOOR-YAZDI M, ASOODEH A, CHAMANI J. A novel antioxidant and antimicrobial peptide from hen egg white lysozyme hydrolysates[J]. Journal of Functional Foods, 2012, 4(1)： 278-286.

[42] CHODA N, YANO Y, MATSUZAKI K. Roles of Lys and Arg in the activity of antimicrobial peptides[J]. Biophysical Journal, 2010, 98(Suppl 1)： 84.

[43] SUGITA-KONISHI Y, SAKANAKA S, SASAKI K, et al. Inhibition of bacterial adhesion and salmonella infection in BALB/c mice by sialyloligosaccharides and their derivatives from chicken egg yolk[J]. J Agric Food Chem, 2002, 50(12)： 3607-3613.

[44] HERVE-GREPINET V, REHAULT-GODBERT S, LABAS V, et al. Purification and characterization of avian beta-defensin 11, an antimicrobial peptide of the hen egg[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2010, 54(10)： 4401-4409.

[45] FJELL C D, HISS J A, HANCOCK R E, et al. Designing antimicrobial peptides： form follows function[J]. Nat Rev Drug Discov, 2012, 11(1)： 37-51.

[46] POWERS J P S, HANCOCK R E W. The relationship between peptide structure and antibacterial activity[J]. Peptides, 2003, 24(11)： 1681-1691.

[47] PELLEGRINI A, THOMAS U, von FELLENBERG R, et al. Bactericidal activities of lysozyme and aprotinin against gram-negative and gram-positive bacteria related to their basic character[J]. J Appl Bacteriol, 1992, 72(3)： 180-187.

[48] BANGALORE N, TRAVIS J, ONUNKA V C, et al. Identifi cation of the primary antimicrobial domains in human neutrophil cathepsin G[J]. J Biol Chem, 1990, 265(23)： 13584-13588.

[49] LEE D G, KIM H N, PARK Y, et al. Design of novel analogue peptides with potent antibiotic activity based on the antimicrobial peptide, HP (2-20), derived from N-terminus of Helicobacter pylori ribosomal protein L1[J]. Biochim Biophys Acta, 2002, 1598(1/2)： 185-194.