缺氧對貝類的脅迫效應及對其免疫系統的影響

周作強，丁晴晴，劉其根，王有基，胡夢紅

上海海洋大學水產與生命學院，上海201306

近年來，盲目追求高密度養殖使得貝類生存環境惡化，進而引發扇貝［1-2］、九孔鮑(Haliotis diversicolor aquatilis)［3］、蛤蜊［4］和牡蠣［5］等高死亡率，從而導致經濟貝類產量大幅下降。隨著水體富營養化引發的一系列生態問題的出現，如有毒水華藻類，水體缺氧等［6-7］，水體富營養化受到各國學者的廣泛關注。其中，與水體富營養化相伴出現的水體缺氧問題已被證實是導致我國煙臺海域扇貝大規模死亡的主要原因［8］。Cheng等［9］的研究也表明，較低溶氧條件(低于2．05mg·L-1)會導致九孔鮑大量死亡。

水體溶氧是水生動物的重要限制因子之一［10］，大量研究表明，水體缺氧將影響到貝類的行為［11］、耗氧率［12-13］、新陳代謝［14-15］、存活率［16-17］和生長［18］，以及貝類的免疫應答［9］等諸多方面。長時間暴露在缺氧環境中將對貝類免疫系統及抗病能力造成嚴重損害，甚至導致貝類死亡［9，19-20］。

貝類屬于無脊椎動物，其體內不具備特異性免疫系統，沒有特異性免疫淋巴細胞、抗體、免疫球蛋白，也沒有二次免疫過程，僅具有血細胞介導的較為完善的非特異免疫系統［21］。然而貝類可以通過一些異于脊椎動物的獨特免疫機制來抵抗外界病原體的侵入，同時能夠進行異己物質的識別［22-23］，貝類的這種免疫機制可以分為細胞免疫與體液免疫。本文概括了國內外有關缺氧脅迫對貝類免疫系統影響及其機理的研究進展，將為貝類養殖學以及病害學領域的深入研究提供基礎理論依據。

1 缺氧對貝類細胞免疫的影響

1．1 缺氧對血細胞總數(THC)的影響

貝類血細胞涉及到吞噬作用、呼吸爆發、包囊作用、炎癥反應以及傷口愈合等一系列免疫防御反應［24］。因此，血細胞在缺乏特異性免疫以及免疫記憶功能的雙殼貝類防御系統中的作用至關重要［25-26］。病毒、污染物以及環境等脅迫因子不僅影響循環血細胞的數量，還影響其活力。當然，循環血細胞和非循環血細胞處于一個動態平衡中，循環血細胞的數量受血細胞在血淋巴與組織間的遷移以及細胞裂解或增值的雙重影響［27］。

大量研究證實，貝類THC與水體溶氧濃度正相關。Chen等［28］的研究證實，櫛孔扇貝(Chlamys farreri)THC會隨溶氧濃度的降低而逐漸減少，并且在溶氧降至2．5 mg·L-1時下降46%，顯著低于對照組。同樣，在 2．05 mg·L-1溶氧條件下暴露 24 h，九孔鮑 THC 下降27%［9］。Yu 等［19］的研究也表明，缺氧會導致四角蛤蜊(M．veneriformis)THC水平的下降。Wang等［29］的研究證實，在3種不同鹽度條件下缺氧組(1．5 mg·L-1)翡翠貽貝(Perna viridis)血淋巴中的THC始終低于正常溶氧組(6．0 mg·L-1)，該實驗中THC的異變除以上所提到的血細胞溶解或擴散外，還可能與鹽度導致血淋巴中自由水的滲透有關。THC的下降勢必導致免疫功能退化［26］。血淋巴中THC的下降可能是血細胞快速向外周組織擴散所致，例如貝類在產卵期間會出現大量血細胞向生殖腺遷移現象［30-32］。現有的研究還不能確定缺氧是否會刺激血細胞的外滲。缺氧導致的THC減少是由血細胞裂解還是血細胞遷移引起還需深入研究。

Matozzoa等［30］指出，缺氧脅迫會導致雞簾蛤(Chamelea gallina)的THC降低，但暴露于缺氧條件下24 h的處理組經過24 h的正常溶氧處理后，其THC可恢復到正常水平;而暴露于缺氧條件下48 h的處理組經過24 h的正常溶氧處理后，其THC仍顯著低于正常水平。空氣暴露(缺氧)被證實會導致四角蛤蜊THC顯著下降，24 h空氣暴露(由于貝類只能利用溶解于水中的氧氣，因此空氣暴露則表示處在一種完全無氧的狀態)處理組在放回正常溶氧的海水24 h后，THC能完全恢復。但是48 h缺氧處理組在24 h復氧條件下暴露，THC只能得到部分恢復［19］。類似的情況也在雞簾蛤［33］和翡翠貽貝［29，34］的實驗中出現。可見短時間的空氣暴露導致貝類THC的下降具有可恢復性，而隨著暴露時間的延長(如超過48 h)，這種可恢復性會逐漸減弱，甚至出現死亡現象。

1．2 缺氧對吞噬作用的影響

貝類的細胞免疫主要通過吞噬作用完成，吞噬作用在控制和殺滅入侵異物上起到了關鍵作用［27，35-36］。血細胞吞噬作用過程主要包括:識別趨化、粘附、內吞和殺滅消化4個階段。研究表明，在2．05 mg·L-1溶氧條件下暴露 24 h 以及 3．57 mg·L-1溶氧條件下處理12 h均會導致九孔鮑吞噬活性的顯著下降［9］。Wang 等［29］的研究結果表明，缺氧組(1．5 mg·L-1)翡翠貽貝在不同鹽度條件下均低于正常溶氧組(6．0 mg·L-1)。當四角蛤蜊［19］暴露在缺氧環境中超過24 h后其吞噬活性也會降低。在貽貝中［37］，這種下降趨勢明顯來得更快，只需暴露于缺氧條件下30 min，其細胞吞噬活性就顯著下降。

Pampanin等［33］的研究表明，雞簾蛤的吞噬活性在缺氧條件下暴露1 d后會出現下降，并且這種下降至少需要3 d時間才能完全恢復。雞簾蛤的吞噬活性在2個缺氧處理組(暴露時間分別為24和48 h)中均出現顯著下降，而24 h復氧處理后24 h缺氧處理組吞噬活性稍高于對照組，但48 h缺氧處理組并未表現出恢復的跡象［33］。缺氧將導致四角蛤蜊吞噬效率顯著下降。24 h空氣暴露處理組在放回海水中24 h后幾乎能完全恢復。但是48 h缺氧處理組經24 h復氧后，只有THC和酚氧化酶(PO)水平得到部分恢復［19］。Wang等［34］的研究也表明，在20°C 條件下，相對于正常溶氧組(6．0mg·L-1)，缺氧組(1．5mg·L-1)翡翠貽貝血細胞的吞噬效率顯著降低，然而轉移到正常溶氧24 h后，這種降低可以完全恢復。

雖然導致吞噬作用衰退現象的機理還不是很清楚，但能夠肯定的是缺氧確實影響了貝類的吞噬能力，并且這種衰退恢復較慢，恢復能力隨著缺氧暴露時間的延長而減弱。

1．3 缺氧對活性氧(ROS)含量的影響

血細胞中的顆粒細胞在環境脅迫、微生物或異物刺激下會出現呼吸爆發，伴隨大量的胞毒活性氧產生，例如超氧陰離子(·O2-)、過氧化氫(H2O2)、單線態氧、羥自由基、硝酸鹽超氧化物陰離子和超鹵化物等。這些活性氧可造成細胞的膜損傷，DNA斷裂，酶抑制和氨基酸氧化等毒性效應［38］。雖然活性氧具有極強的殺毒滅菌能力，但過多的活性氧會導致生物氧化應激，使細胞損害、突變、死亡，免疫功能下降等［39-40］。

缺氧脅迫對貝類細胞活性氧含量的影響是正面還是負面還存在一定爭議［9，41-42］。Cheng 等［9］發現，在2．05mg·L-1溶氧條件下暴露24 h會導致臺灣九孔鮑細胞中ROS含量下降。Yu等［19］的研究結果也證實，缺氧會導致四角蛤蜊細胞中ROS含量顯著下降。類似的結果也出現在翡翠貽貝的缺氧實驗中［34］。然而，也有研究表明，急性缺氧脅迫會使扇貝血細胞ROS含量出現升高的現象，例如扇貝在25℃空氣暴露2 h或者17℃下空氣暴露24 h時，其細胞中ROS含量顯著上升，在5°C條件下缺氧處理組經24 h恢復后扇貝的ROS含量顯著高于其恢復之前含量甚至比最初水平還要高［43］。Wang等［34］的研究表明，翡翠貽貝在30°C 下缺氧(1．5 mg·L-1)處理24 h，其血細胞中 ROS 含量顯著高于正常溶氧組(6．0mg·L-1)。

盡管上述文獻表明，缺氧會影響貝類細胞中ROS的產生，但其影響機制尚不明確。Lacoste等［44］報道，牡蠣(Crassotrea gigas)的免疫應答由血淋巴中去甲腎上腺素(軟體動物主要的兒茶酚胺類物質)的釋放來調節。去甲腎上腺素的釋放，不僅對一系列的細胞免疫應答有抑制效果還能明顯減少ROS的產生。Yu等［19］關于四角蛤蜊缺氧脅迫對其免疫應答影響的實驗，雖然沒有測定去甲腎上腺素的含量，但仍可以依據實驗結果推測，缺氧脅迫引發的去甲腎上腺素的釋放可能導致ROS產量的下降并伴隨著超氧化物歧化酶(SOD)活性的下降。

2 缺氧對貝類體液免疫因子的影響

體液免疫和細胞免疫是貝類免疫機制的兩個方面。體液免疫作為貝類的重要免疫防御手段，是依靠血清中的一些非特異性酶和調節因子來進行。目前已確定的體液免疫因子主要包括溶酶體酶、抗氧化物酶、抗氧化因子、酚氧化酶、髓性過氧化物酶(MPO)、凝集素、調理素、抗菌肽、應激蛋白和細胞因子類似物等［39］，其中溶酶體酶和抗氧化防御系統在免疫防御中起著至關重要的作用。大多數體液免疫因子是由貝類血細胞產生并分泌到血淋巴中發揮防御功能的，由此可見體液免疫和細胞免疫是相互聯系，協同作用的。

2．1 缺氧對貝類溶酶體酶類的影響

溶酶體酶類主要來源于血細胞和血淋巴，由血細胞的溶酶體與質膜融合后分泌到胞外。貝類溶酶體酶主要包括溶菌酶(LSZ)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(ALP)等。

2．1．1 缺氧對溶菌酶(LSZ)的影響

LSZ是幾種革蘭氏陽性和陰性菌的主要殺菌劑［29，45］。LSZ在吞噬作用過程中，由貝類的血細胞合成并分泌到血淋巴中［46］。LSZ是貝類非特異性免疫的重要組成部分。由于溶酶體中的蛋白酶、氨肽酶、脂肪酶、葡萄糖苷酶等還能消化蛋白質、脂肪和糖類，使得溶酶體兼有防御和消化的雙重功能［39］。因此LSZ活性可作為評價貝類健康狀況以及防御系統活力的一個重要指標［47］。

有研究表明，在缺氧脅迫下硬殼蛤的LSZ活性表現出下降趨勢［48］。Wang等［29］也發現，暴露于缺氧條件下(24、48和72 h)會導致翡翠貽貝LSZ活性的降低，但只有暴露于缺氧條件下24 h的翡翠貽貝能恢復LSZ的活性。河蜆不同溶氧梯度脅迫實驗表明，在第7天時，各組的LSZ活性均升高，而富氧組(11．0 mg·L-1)的LSZ活性最高，顯著高于對照組(8．0 mg·L-1)和低氧組(2．0 mg·L-1)。隨著脅迫時間的延長，各組LSZ活性均降低;到第21天時，3個組的LSZ活性均低于實驗前的水平。富氧組和低氧組在應激下的溶菌酶活性均高于對照組，富氧組的LSZ活性始終高于低氧組的水平，這可能與水體中各種微生物的生長變化有關［49］。在翡翠貽貝的實驗中，發現缺氧組(1．5 mg·L-1)LSZ活性顯著低于正常溶氧組(6．0mg·L-1)［34］。

翡翠貽貝24和48 h缺氧處理后，血細胞裂解產物中與脫細胞血淋巴中的溶菌酶活性均出現顯著下降［29］。經24 h復氧后，血細胞裂解產物中的溶菌酶活性仍然顯著低于對照組和缺氧組，而血清中的溶菌酶活性顯著高于對照組。相反，48 h缺氧處理組，雖然經24h的恢復處理，但LSZ活性仍然都顯著低于對照組［29］。

2．1．2 缺氧對磷酸酶的影響

酸性磷酸酶(ACP)作為溶酶體的標志性酶，在免疫反應中起到殺滅和消化病原微生物的作用。堿性磷酸酶(ALP)屬于多功能酶，參與貝類免疫反應，并在免疫反應中與超氧化物歧化酶和酸性磷酸酶具有緊密的聯系［50-51］。在較低溶氧水平(4．5和2．5 mg·L-1)條件下，7d內，櫛孔扇貝ACP活性沒有顯著變化，之后出現下降，直至顯著低于正常水平［28］。在感染病原菌的實驗中，發現淡水光滑雙臍螺(Biomphalariaglabrata)血清中的 ACP水平有所上升［52］。只有在2．5mg·L-1溶氧條件下處理12h，櫛孔扇貝ALP活性才出現顯著更高的水平，而其他不同氧溶度處理以及不同的取樣時間的ALP活性都在小范圍內波動［28］。大量研究表明，在貝類免疫應答中SOD、ACP和ALP是緊密相關的［50-51］。因此，可通過檢測THC、SOD活性、ACP活性和ALP活性來監控貝類在不同氧溶度梯度下的免疫應答。

2．2 缺氧對貝類抗氧化防御系統的影響

抗氧化防御系統主要由酶抗氧化物酶和抗氧化物因子兩部分構成，在抗氧化防御過程中兩者相互聯系，協同作用。抗氧化物酶主要有超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽轉移酶(GST)和酚氧化酶(PO)等［9］。抗氧化物因子主要包括谷胱甘肽(GSH)、維生素A、維生素C、維生素E、β—胡蘿卜素和尿酸等。

2．2．1 缺氧對 SOD 的影響

在免疫應答中，SOD作為消除自由基團的主要酶，對于減少宿主細胞的氧化損傷是必不可少的［53-54］。胡曉等［55］對背角無齒蚌(Anodontawoodiana)和三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)血淋巴SOD的研究顯示，活性氧可能在河蚌的正常生命活動中發揮重要功能，而SOD則是一切需氧有機體清除

O-2·，保護機體免受氧化傷害的關鍵酶，其活性與生物的免疫功能密切相關。

Chen 等［28］指出，在較高氧溶度水平(8．5 或 6．5mg·L-1)條件下，櫛孔扇貝SOD活性在整個實驗過程中都維持的相當穩定。而在較低溶氧水平(4．5或2．5mg·L-1)，其 SOD活性呈現出峰形變化趨勢，12h前呈顯著上升趨勢，之后出現顯著下降，直至正常水平以下。Santovito等［56］報道稱，低溶氧會降低地中海貽貝消化腺中SOD的活性。河蜆的溶氧梯度實驗也符合這一規律［49］。

2．2．2 缺氧對GPx的影響

貝類GPx主要存在于鰓組織中。由于GPx更傾向于除去SOD歧化·O2-產生的H2O2，故在不同溶氧梯度下貝類鰓中GPx活性與SOD活性緊密相關［56］。但是這2種抗氧化物酶在消化腺中含量較少，故不存在相關性［56］。許友卿等［57］發現，在缺氧條件下，8h后皺紋盤鮑SeGPx基因的表達量是正常情況下的16．8倍，這可能與缺氧導致的ROS含量增加有關。

2．2．3 缺氧對CAT的影響

與SOD以及GPx不同，CAT參與去除食物消化過程中產生的H2O2，因此消化腺CAT含量高于鰓組織中的CAT含量。CAT活性與SOD活性存在一定的相關性［56］。例如，在對皺紋盤鮑CAT的研究中，缺氧處理2h后皺紋盤鮑CAT基因表達量出現少量上升，之后又緩慢減少，這一變化趨勢與SOD的基因表達量的變化趨勢相吻合［57］。

2．2．4 缺氧對酚氧化酶(PO)的影響

PO是一種具有氧化活力的銅蛋白酶，作為酶類氧化蛋白酶之一，在貝類的防御系統中扮演著重要的角色。當機體受到損傷時，作為貝類一系列免疫防御因子級聯反應的最后一個組件—PO將由免疫感受態血細胞釋放到血淋巴中［58］。在開放式的貝類循環系統中，能及時反應、識別異物并通過防衛機制阻止傷口異物的入侵，防止血液流失等［59］。四角蛤蜊在缺氧條件下表現出較低的PO活性，表明在缺氧環境中四角蛤蜊的免疫功能減退，此時其將變得更容易被病原菌感染［19］。臺灣九孔鮑PO活性在3．57和2．05mg·L-1溶氧條件下出現顯著升高，分別升高 38% 和 69%［9］。Moullac等［60］推測這可能與PrPO系統等離子體抑制劑數量的減少有關。

3結語

綜上所述，在缺氧條件下THC的下降往往伴隨著吞噬活性以及ROS含量的下降［19］。吞噬作用涉及到呼吸爆發過程所伴隨的活性氧的產生;呼吸爆發中活性氧的產生水平又取決于血淋巴中的循環血細胞含量，反過來活性氧含量又會影響血細胞的存活率。由此推測，在缺氧脅迫下貝類細胞免疫系統中血細胞總數、吞噬活性以及呼吸爆發的異變都是聯動的，且都呈現出下降的趨勢。體液免疫中SOD活性受呼吸爆發伴隨的ROS的產生所誘導，在缺氧脅迫早期階段SOD活性會有所上升［29，48］，而隨著呼吸爆發的減弱以及循環血細胞總數的下降SOD活性也會迅速下降，在這個過程中貝類鰓組織中的CAT和GSH-Px活性幾乎與SOD活性保持一致步調［61］。缺氧環境中溶菌酶活性的降低直接影響吞噬效率，而溶菌酶又由循環血細胞分泌產生。因此，缺氧脅迫對貝類體液免疫系統的負面影響與細胞免疫系統的基本保持一致。因此，缺氧脅迫將導致貝類免疫系統的衰退，大量文獻顯示，24 h(臨界點)以內缺氧脅迫對貝類免疫系統的負面影響是可逆的，即這種強度的缺氧脅迫在貝類免疫系統的承受范圍之內，當暴露于缺氧環境超過一定時間，缺氧脅迫就可能對貝類細胞免疫系統造成不可逆損傷，甚至導致貝類的死亡［19，29，43］。

近年來，由于我國貝類尤其是淡水珍珠蚌養殖規模的迅速擴大，導致水體嚴重富營養化，水華頻發，致使水體中貝類急性缺氧。因此，研究貝類在缺氧環境下免疫功能的變化具有重要的生產實踐意義。目前，有關缺氧對貝類免疫系統影響的研究尚有報道，但是與其他環境因子共同影響貝類的交互作用的研究還很少，而有毒物質例如水華藻類爆發所產生的生物毒素——微囊藻毒素與缺氧交互作用對貝類的研究還屬空白。然而在實際生產中往往又是多因素脅迫共同存在，其間的關系或者協同或者拮抗也可能相互獨立。因此，研究多因素對貝類免疫功能的影響應該成為今后貝類毒理生理學的主要研究方向。

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