腫瘤標志蛋白檢測新技術及其在癌癥早期診斷中的應用

摘 要：癌癥這一惡性疾病每年都奪走了數(shù)以千萬計的生命，早診早治是降低死亡率最為有效的手段。因此，發(fā)展簡單、快速、靈敏，甚至實時、原位、在體的蛋白質檢測方法，不僅已成為蛋白質科學研究的重點和熱點，而且在疾病的臨床診斷領域具有十分重要的意義。

關鍵詞：癌癥；腫瘤細胞檢測；金納米顆粒發(fā)

中圖分類號：R73 文獻標識碼：A

近幾年，隨著生物化學、生物物理學、分析化學等多學科研究的不斷交叉融合，蛋白質傳感技術的出現(xiàn)和快速發(fā)展為蛋白質相關生命活動的表征以及疾病的診斷、治療和療效評估等提供了新的契機。蛋白質傳感技術是一類利用電化學、光學、熱學和聲學等信號轉換原理，結合多種蛋白質分子識別元件，將對蛋白質分子的識別事件轉換為可檢測信號的分析方法。

1 基于葉酸功能化金納米顆粒發(fā)展腫瘤細胞檢測新方法的研究

葉酸受體是在多種腫瘤細胞表面過量表達的一種腫瘤標志物，能與葉酸進行特異性地結合。我們將葉酸功能化的金納米顆粒修飾到電極表面用于特異性地識別和\"捕獲\"腫瘤細胞，利用鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀作為電化學探針，采用電化學手段對\"捕獲\"的腫瘤細胞進行了檢測，從而為腫瘤細胞的檢測以及癌癥的早期診斷提供了可能的新的解決方案。實驗結果表明：含有靶細胞的樣品處理過的電極在電化學探針溶液中獲得的電化學信號較處理前有明顯降低且隨著處理時間的增加，降低趨勢愈加明顯，而在對照實驗中，正常細胞只產(chǎn)生微弱的信號變化。該方法整個檢測過程非常快速，半小時就可以知道結果，而且操作簡便，僅僅需要將電極插入待檢測的細胞液中，半小時以后比較電化學信號變化的強度即可，充分顯示了電化學檢測技術的優(yōu)勢（Electrochem. Comm.， 2007， 9： 2547-2550）。

2基于端粒酶活性檢測新方法發(fā)展腫瘤細胞檢測新技術的研究

端粒酶是一種廣泛存在于各類腫瘤細胞中的標志性蛋白，主要用于端粒的修復延長，其激活和表達程度與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，因此，快速簡便地檢測端粒酶的活性對癌癥的早期診斷有著重要的意義。我們將DNA引物固定于金電極表面，并使用提取于HeLa細胞的端粒酶樣品與之作用，使引物發(fā)生端粒延長化反應。端粒酶的活性越強，端粒延長化反應的進行性就越強，從而生成的端粒重復序列就越多，其中包含的鳥嘌呤數(shù)量也就越多，由于在一定的電位下，鳥嘌呤會被特異性氧化而產(chǎn)生氧化峰電流，因此，基于上述原理，我們建立了利用鳥嘌呤的氧化峰電流大小來表征端粒酶活性的電化學檢測體系。該體系無需PCR擴增，且具有較高的靈敏度，檢測下限達到50 ng/μL，即3000個細胞中端粒酶的含量就可以表現(xiàn)出很強的檢測信號Electrochem. Commun.， 2008， 10： 1502-1504）。

3金納米顆粒與適體偶聯(lián)用于檢測血小板衍生生長因子的研究

血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）是來自血小板的一種蛋白質，也存在于一些結締組織細胞。PDGF是由兩個亞基組成的二聚體蛋白質，根據(jù)PDGF的多肽鏈組成不同可以分為三種：PDGF-AA，PDGF-BB和PDGF-AB，其中PDGF-BB是與腫瘤生長直接相關，在一些腫瘤如肉瘤細胞中過量表達，并且在腫瘤惡變過程中PDGF的自分泌和旁分泌效應會加強。因此人們發(fā)展了很多方法來檢測PDGF，包括傳統(tǒng)的ELISA，以及基于PDGF與相應抗體相互作用的方法。我們以血小板衍生生長因子與其適體之間的分子識別和形成的\"夾心\"結構復合物為基礎，利用金納米顆粒進行信號放大，構建了一種新型電化學生物傳感器，用于血小板衍生因子的檢測。實驗結果表明，由于金納米顆粒的參與和復合物結構的形成，極大地增強了電化學探針釕復合物的信號，因此，該傳感器的檢測靈敏度大大提高，純化樣品中的檢測下限可達到1×10-14M，血清樣品也可達1×10-12M。同時，實驗證明該檢測系統(tǒng)具有良好的穩(wěn)定性和特異性（Biosensors and Bioelectronics， 2009， 24： 1598-1602）。

4基于 CdS 納米顆粒檢測乳腺癌細胞新方法的研究

乳腺癌的準確檢測具有重要的意義，不僅有利于確診疾病的發(fā)展程度，而且有助于后期治療方案的制定。我們通過設計可以同時識別兩種細胞表面標志物（MUC1 和癌胚抗原）的方案，從而提出了一種準確檢測乳腺癌細胞的電化學免疫檢測方法，而且，該方法的特異性和靈敏度也較高，在臨床診斷方面具有很大的應用潛力。實驗結果表明，只有當兩種細胞標志物同時存在的情況下，才能得到 CdS 納米顆粒的溶出伏安電化學信號，而且，該方法能將乳腺癌細胞與其它種類細胞，如急性白血病細胞和正常胰島 beta 細胞區(qū)分開來，有效避免了腫瘤細胞檢測中極易出現(xiàn)的假陽性結果。

5聯(lián)合檢測兩種腫瘤標志物的適體電化學生物傳感器的構建

由于一種腫瘤可以有多種標志物，一種標志物也可能存在于多種腫瘤或者組織中，因此，同時檢測兩種或多種共同存在的相關的腫瘤標志物可以有效地排除假陽性結果，提高腫瘤檢測的準確性，更利于腫瘤的臨床診斷與治療，為此，我們創(chuàng)建了一個新穎的利用二茂鐵標記的適體互補鏈DNA（cDNA）作為探針，同時檢測兩種腫瘤標志物的\"signal-on（信號增強）\"型適體電化學生物傳感器，其原理如下：固定在電極表面的cDNA由于兩端的序列互補可以自發(fā)形成莖環(huán)結構，從而使二茂鐵充分靠近電極。當cDNA與MUC1適體以及VEGF165適體雜交后會形成一個長雙鏈結構，此時二茂鐵遠離電極表面。但是，當體系中存在腫瘤標志物的時候，腫瘤標志物會阻止cDNA與適體雜交，從而改變二茂鐵和電極表面之間的距離。由于電化學信號隨著cDNA構象的變化而變化，因此，通過電化學信號的變化就可以實現(xiàn)兩種腫瘤標志物的檢測。實驗結果表明，二茂鐵的電化學信號隨著腫瘤標志物濃度的增大而增強，而且只有在兩種腫瘤標志物同時存在的情況下，才能得到最強的電化學信號。

結語

隨著蛋白質電化學研究方法的不斷完善，各種功能材料、尤其是納米材料的廣泛使用，以及近年來表面修飾技術、分子標記與分子識別技術、納米技術等相關技術的不斷發(fā)展，電化學測試手段在蛋白質科學研究以及蛋白質分析新方法研究領域發(fā)揮了越來越重要的作用，為腫瘤標志蛋白簡單、快速、靈敏，甚至實時、原位、在體檢測創(chuàng)造了條件，在癌癥早期診斷方面顯示了獨特的技術優(yōu)勢。

參考文獻

[1]王清華.腫瘤標志物檢測在腫瘤早期診斷中的作用[J].中外健康文摘，2011（10）.

[2]張建中，鄭燕華， 馮凱，鄒德威.SELDI蛋白指紋技術在腫瘤早期診斷中的應用[J].世界華人消化雜志，2004（12）.