腫瘤標(biāo)志蛋白檢測(cè)新技術(shù)及其在癌癥早期診斷中的應(yīng)用

摘 要：癌癥這一惡性疾病每年都奪走了數(shù)以千萬(wàn)計(jì)的生命，早診早治是降低死亡率最為有效的手段。因此，發(fā)展簡(jiǎn)單、快速、靈敏，甚至實(shí)時(shí)、原位、在體的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，不僅已成為蛋白質(zhì)科學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，而且在疾病的臨床診斷領(lǐng)域具有十分重要的意義。

關(guān)鍵詞：癌癥；腫瘤細(xì)胞檢測(cè)；金納米顆粒發(fā)

中圖分類(lèi)號(hào)：R73 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

近幾年，隨著生物化學(xué)、生物物理學(xué)、分析化學(xué)等多學(xué)科研究的不斷交叉融合，蛋白質(zhì)傳感技術(shù)的出現(xiàn)和快速發(fā)展為蛋白質(zhì)相關(guān)生命活動(dòng)的表征以及疾病的診斷、治療和療效評(píng)估等提供了新的契機(jī)。蛋白質(zhì)傳感技術(shù)是一類(lèi)利用電化學(xué)、光學(xué)、熱學(xué)和聲學(xué)等信號(hào)轉(zhuǎn)換原理，結(jié)合多種蛋白質(zhì)分子識(shí)別元件，將對(duì)蛋白質(zhì)分子的識(shí)別事件轉(zhuǎn)換為可檢測(cè)信號(hào)的分析方法。

1 基于葉酸功能化金納米顆粒發(fā)展腫瘤細(xì)胞檢測(cè)新方法的研究

葉酸受體是在多種腫瘤細(xì)胞表面過(guò)量表達(dá)的一種腫瘤標(biāo)志物，能與葉酸進(jìn)行特異性地結(jié)合。我們將葉酸功能化的金納米顆粒修飾到電極表面用于特異性地識(shí)別和\"捕獲\"腫瘤細(xì)胞，利用鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀作為電化學(xué)探針，采用電化學(xué)手段對(duì)\"捕獲\"的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)，從而為腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)以及癌癥的早期診斷提供了可能的新的解決方案。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：含有靶細(xì)胞的樣品處理過(guò)的電極在電化學(xué)探針溶液中獲得的電化學(xué)信號(hào)較處理前有明顯降低且隨著處理時(shí)間的增加，降低趨勢(shì)愈加明顯，而在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，正常細(xì)胞只產(chǎn)生微弱的信號(hào)變化。該方法整個(gè)檢測(cè)過(guò)程非常快速，半小時(shí)就可以知道結(jié)果，而且操作簡(jiǎn)便，僅僅需要將電極插入待檢測(cè)的細(xì)胞液中，半小時(shí)以后比較電化學(xué)信號(hào)變化的強(qiáng)度即可，充分顯示了電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)（Electrochem. Comm.， 2007， 9： 2547-2550）。

2基于端粒酶活性檢測(cè)新方法發(fā)展腫瘤細(xì)胞檢測(cè)新技術(shù)的研究

端粒酶是一種廣泛存在于各類(lèi)腫瘤細(xì)胞中的標(biāo)志性蛋白，主要用于端粒的修復(fù)延長(zhǎng)，其激活和表達(dá)程度與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，因此，快速簡(jiǎn)便地檢測(cè)端粒酶的活性對(duì)癌癥的早期診斷有著重要的意義。我們將DNA引物固定于金電極表面，并使用提取于HeLa細(xì)胞的端粒酶樣品與之作用，使引物發(fā)生端粒延長(zhǎng)化反應(yīng)。端粒酶的活性越強(qiáng)，端粒延長(zhǎng)化反應(yīng)的進(jìn)行性就越強(qiáng)，從而生成的端粒重復(fù)序列就越多，其中包含的鳥(niǎo)嘌呤數(shù)量也就越多，由于在一定的電位下，鳥(niǎo)嘌呤會(huì)被特異性氧化而產(chǎn)生氧化峰電流，因此，基于上述原理，我們建立了利用鳥(niǎo)嘌呤的氧化峰電流大小來(lái)表征端粒酶活性的電化學(xué)檢測(cè)體系。該體系無(wú)需PCR擴(kuò)增，且具有較高的靈敏度，檢測(cè)下限達(dá)到50 ng/μL，即3000個(gè)細(xì)胞中端粒酶的含量就可以表現(xiàn)出很強(qiáng)的檢測(cè)信號(hào)Electrochem. Commun.， 2008， 10： 1502-1504）。

3金納米顆粒與適體偶聯(lián)用于檢測(cè)血小板衍生生長(zhǎng)因子的研究

血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor，PDGF）是來(lái)自血小板的一種蛋白質(zhì)，也存在于一些結(jié)締組織細(xì)胞。PDGF是由兩個(gè)亞基組成的二聚體蛋白質(zhì)，根據(jù)PDGF的多肽鏈組成不同可以分為三種：PDGF-AA，PDGF-BB和PDGF-AB，其中PDGF-BB是與腫瘤生長(zhǎng)直接相關(guān)，在一些腫瘤如肉瘤細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)，并且在腫瘤惡變過(guò)程中PDGF的自分泌和旁分泌效應(yīng)會(huì)加強(qiáng)。因此人們發(fā)展了很多方法來(lái)檢測(cè)PDGF，包括傳統(tǒng)的ELISA，以及基于PDGF與相應(yīng)抗體相互作用的方法。我們以血小板衍生生長(zhǎng)因子與其適體之間的分子識(shí)別和形成的\"夾心\"結(jié)構(gòu)復(fù)合物為基礎(chǔ)，利用金納米顆粒進(jìn)行信號(hào)放大，構(gòu)建了一種新型電化學(xué)生物傳感器，用于血小板衍生因子的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，由于金納米顆粒的參與和復(fù)合物結(jié)構(gòu)的形成，極大地增強(qiáng)了電化學(xué)探針釕復(fù)合物的信號(hào)，因此，該傳感器的檢測(cè)靈敏度大大提高，純化樣品中的檢測(cè)下限可達(dá)到1×10-14M，血清樣品也可達(dá)1×10-12M。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)證明該檢測(cè)系統(tǒng)具有良好的穩(wěn)定性和特異性（Biosensors and Bioelectronics， 2009， 24： 1598-1602）。

4基于 CdS 納米顆粒檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞新方法的研究

乳腺癌的準(zhǔn)確檢測(cè)具有重要的意義，不僅有利于確診疾病的發(fā)展程度，而且有助于后期治療方案的制定。我們通過(guò)設(shè)計(jì)可以同時(shí)識(shí)別兩種細(xì)胞表面標(biāo)志物（MUC1 和癌胚抗原）的方案，從而提出了一種準(zhǔn)確檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞的電化學(xué)免疫檢測(cè)方法，而且，該方法的特異性和靈敏度也較高，在臨床診斷方面具有很大的應(yīng)用潛力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，只有當(dāng)兩種細(xì)胞標(biāo)志物同時(shí)存在的情況下，才能得到 CdS 納米顆粒的溶出伏安電化學(xué)信號(hào)，而且，該方法能將乳腺癌細(xì)胞與其它種類(lèi)細(xì)胞，如急性白血病細(xì)胞和正常胰島 beta 細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)，有效避免了腫瘤細(xì)胞檢測(cè)中極易出現(xiàn)的假陽(yáng)性結(jié)果。

5聯(lián)合檢測(cè)兩種腫瘤標(biāo)志物的適體電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建

由于一種腫瘤可以有多種標(biāo)志物，一種標(biāo)志物也可能存在于多種腫瘤或者組織中，因此，同時(shí)檢測(cè)兩種或多種共同存在的相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物可以有效地排除假陽(yáng)性結(jié)果，提高腫瘤檢測(cè)的準(zhǔn)確性，更利于腫瘤的臨床診斷與治療，為此，我們創(chuàng)建了一個(gè)新穎的利用二茂鐵標(biāo)記的適體互補(bǔ)鏈DNA（cDNA）作為探針，同時(shí)檢測(cè)兩種腫瘤標(biāo)志物的\"signal-on（信號(hào)增強(qiáng)）\"型適體電化學(xué)生物傳感器，其原理如下：固定在電極表面的cDNA由于兩端的序列互補(bǔ)可以自發(fā)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從而使二茂鐵充分靠近電極。當(dāng)cDNA與MUC1適體以及VEGF165適體雜交后會(huì)形成一個(gè)長(zhǎng)雙鏈結(jié)構(gòu)，此時(shí)二茂鐵遠(yuǎn)離電極表面。但是，當(dāng)體系中存在腫瘤標(biāo)志物的時(shí)候，腫瘤標(biāo)志物會(huì)阻止cDNA與適體雜交，從而改變二茂鐵和電極表面之間的距離。由于電化學(xué)信號(hào)隨著cDNA構(gòu)象的變化而變化，因此，通過(guò)電化學(xué)信號(hào)的變化就可以實(shí)現(xiàn)兩種腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，二茂鐵的電化學(xué)信號(hào)隨著腫瘤標(biāo)志物濃度的增大而增強(qiáng)，而且只有在兩種腫瘤標(biāo)志物同時(shí)存在的情況下，才能得到最強(qiáng)的電化學(xué)信號(hào)。

結(jié)語(yǔ)

隨著蛋白質(zhì)電化學(xué)研究方法的不斷完善，各種功能材料、尤其是納米材料的廣泛使用，以及近年來(lái)表面修飾技術(shù)、分子標(biāo)記與分子識(shí)別技術(shù)、納米技術(shù)等相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展，電化學(xué)測(cè)試手段在蛋白質(zhì)科學(xué)研究以及蛋白質(zhì)分析新方法研究領(lǐng)域發(fā)揮了越來(lái)越重要的作用，為腫瘤標(biāo)志蛋白簡(jiǎn)單、快速、靈敏，甚至實(shí)時(shí)、原位、在體檢測(cè)創(chuàng)造了條件，在癌癥早期診斷方面顯示了獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。

參考文獻(xiàn)

[1]王清華.腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)在腫瘤早期診斷中的作用[J].中外健康文摘，2011（10）.

[2]張建中，鄭燕華， 馮凱，鄒德威.SELDI蛋白指紋技術(shù)在腫瘤早期診斷中的應(yīng)用[J].世界華人消化雜志，2004（12）.