熒光免疫層析試條定量檢測儀的研制

摘 要： 為了對AMI疑似患者進行現場快速篩查，研制了一款可對AMI熒光免疫層析試條進行定量、快速檢測的儀器。該儀器主要由光路單元、數據采集單元、處理及顯示單元組成，激發光聚焦于試條上產生熒光，熒光通過收集光路聚焦于線陣CCD，ARM9芯片通過CCD的灰度值對試條進行判斷。測試結果表明，儀器檢測得到試條的相對熒光強度與心肌標志物濃度成正比，該儀器可實現對患者心肌標志物濃度的定量檢驗，為患者病情的診斷和康復提供了有力保證。

關鍵詞： 熒光免疫層析試條； 試條檢測； 熒光激發收集； 線陣CCD

中圖分類號： TN710?34； TP212.3 文獻標識碼： A 文章編號： 1004?373X（2013）15?0095?04

Development of quantitative testing instrument for fluorescence

immunochromatographic strip

LIU Ting?ting， QU Xuan?ting

（Department of Mechanical and Electrical Engineering， Xiamen University， Xiamen 361005， China）

Abstract： An instrument was designed for achieving quantitative and fast detection on acute myocardial infarction （AMI） fluorescence immunochromatographic strip to conduct on?site and rapid screening for patients with suspected AMI. The instrument consists of optical elements， data acquisition unit， processing and display unit. The excitation light is focused on the strip to produce fluorescence， which will be focused on linear array CCD through collecting light path afterwards， and then the ARM9 chip is used to judge the strip through the gray value of CCD. The test results indicate that the relative fluorescence intensity on strips detected by the instrument is in direct proportion to cardiac biomarker concentrations. This instrument can achieve quantitative detection on cardiac biomarker concentrations of patients， which provides a strong guarantee for the diagnosis and rehabilitation of patients.

Keywords： fluorescence immunochromatographic strip； testing?strip detection； fluorescence excitation and collection； linear array CCD

0 引 言

急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction，AMI）是一類由于冠狀動脈急性閉塞，導致血流驟減而引起心肌細胞缺氧性壞死的疾病，其發病率和死亡率在全球居高不下。每年由AMI引起的死亡人數占心血管疾病死亡人數的一半以上。近年來研究發現AMI患者在發病前一周左右，血液中的心肌標志物濃度會產生變化：如肌鈣蛋白（CTn?I）、心型脂肪酸結合蛋白（H?FABP）[[1?2]。]AMI的治療時間十分重要，早發現并實施院前急救是降低死亡率極為重要的環節，也是提高再灌注率和成功率的關鍵[3]。

目前，用于心肌標志物的即時檢驗方法主要是膠體金免疫檢測技術：使用膠體金作為標記物，標記物與待測物的絡合物被相應的配體捕獲而濃集顯色，以纖維膜上顯色帶的有無進行定性檢測[4]。但膠體金標記利用靜電吸附，在液相中穩定性較差，已標記上的蛋白質分子容易脫落，并且具有產品質量相差大，不宜質控，不能確保質量等缺點[5]。

近幾年出現的熒光免疫層析技術，結合納米技術，定向標記技術、生物膜技術、橫向流體技術及熒光檢測技術，采用化學偶聯方法標記抗體，具備了膠體金檢測產品原有的優勢，也克服了其固有缺陷，其靈敏度高、特異性強、且能夠定量反應血液中心肌標記物的濃度。目前，福建泰普生物科學有限公司已成功研制出針對該心肌標志物檢測的熒光免疫層析試條，本文針對該試條研制了一款可在現場進行快速、準確、定量檢測的儀器。

1 試條檢測原理

試條結構如圖1所示。本文主要對熒光免疫層析試條進行檢測。其工作原理為：將一定量患者的血液滴加在樣品墊上，血液通過層析作用向前移動，溶解結合墊上固化的標記試劑后與之反應。當血液移動至抗原的檢測帶時，待測物和試劑的復合物與之發生特異性結合后被截留，結合物在檢測線上富集，附著的結合物含量與樣品中待測物含量成正比。該結合物具有如下特性：在紫外光的激發下，能激發產生615 nm的紅光。當激發光波長為330 nm時，激發效率最高，反應結合物的激發光譜及熒光光譜如圖2所示。激發光飽和時，激發產生的熒光強度與試條上富集的反應結合物數量成正比。

圖1 熒光免疫層析試條

圖2 反應結合物的激發光譜

往試條樣品墊滴入血液樣品后，在330 nm激發光激發下，試條產生的熒光情況如圖3所示。圖3（a）為樣品中待測物質含量較高時的發光情況；圖3（b）為樣品中待測物質含量較低時的發光情況；圖3（c）檢測帶無熒光，質控帶發熒光，為樣品中無待測物質的發光情況；圖3（d）檢測帶發熒光，質控帶無熒光，為試條失效的情況。在試條有效的情況下（圖3（a）～圖3（c）），可以通過檢測質控帶和檢測帶中反應生成的結合物的數量，即檢測質控帶的熒光發射強度（OD質控帶）與檢測帶的熒光發射強度（OD檢測帶），通過二者的比值[OD檢測帶OD頂控帶]，定量檢測血液樣品所含心肌標志物的濃度。

2 系統設計

2.1 檢測原理及儀器整體設計

儀器要求：將定量的患者血液滴加在試條的樣品墊上后，將試條插入檢測儀器中，便可得到患者心肌標志物的濃度，對患者的病情做出判斷。

圖3 試條熒光激發情況

儀器的本質：檢測質控帶及檢測帶的熒光強度。選擇合適的激發光源，設計相應的激發光路，將激發光聚焦在試條上，測試帶及質控帶產生的熒光通過熒光收集光路，聚焦在線陣CCD上，將光信號轉換為電信號。通過建立測試數據與被測樣品濃度一一對應的數學模型，將熒光密度的比值轉換為患者血液中該心肌標志物的濃度，并顯示輸出。

該儀器的組成主要包括以下三個部分：光學單元（包括紫外激發光路、熒光采集光路）、光電轉換單元、信號處理及顯示單元。下面將對以上三個單元具體說明。

2.2 光學單元設計

光學系統所要完成的功能是：波長為330 nm的紫外光通過激發光路聚焦于試條上的檢測帶和質控帶，使反應結合物產生熒光，受激產生的熒光通過熒光收集光路聚焦于線陣CCD上。激發及熒光收集光路的效率、靈敏度直接決定著檢測結果的準確性。

2.2.1 激發光路要求

如圖1所示，熒光免疫層析試條的規格如下：檢測帶、質控帶寬1 mm，長4 mm，檢測帶與質控帶之間間隔2 mm。只需用一個波長為330 nm，尺寸略大于4 mm×4 mm，有足夠光強的紫外光斑照射該試條，便能使試條的檢測帶和質控帶被完全覆蓋，二者被完全激發，產生熒光。

由于LED具有功耗低、發光壽命長、光強穩定（在恒流供電的情況下）等優點，儀器選用中心波長為330 nm的紫外LED作為激發光源。其發光功率為0.2 W，發射角度為120°，發光晶片規格為1 mm×1 mm。由于所選用的紫外LED功率較小（高功率的紫外LED價格十分昂貴），且發射角度較大，此紫外激發光路具有高效的聚光能力。

2.2.2 熒光檢測光路要求

檢測帶、質控帶受激產生的熒光強度較弱，且是根據二者的熒光相對強度來判斷病情，因此，要求熒光收集光路要高效的收集效率、高靈敏度及一定的空間分辨率。

2.2.3 光路設計

設計的光路如圖4所示。光路由橢球透鏡L1，石英平凸透鏡L2，L3，L4，二向色鏡L5、濾光片L6組成。二向色鏡L5將紫外激發光路（由L1，L2，L5，L3構成）和熒光收集光路（由L3，L5，L4，L6構成）結合起來，整個光路更緊湊，縮小了光學單元的體積。

圖4 光路原理圖

光路說明：橢球反射鏡L1起聚光作用。選擇合適的橢球反射鏡，將紫外LED放在橢球反射鏡L1的第一焦點F1上，則LED發出的大部分光可聚焦在橢球反射鏡的第二焦點F2上[6]；平凸透鏡L2起準直作用。其焦距為[f2，]F2即是橢球透鏡的第二焦點，也是平凸透鏡L2的焦點，透過L2的光將平行出射；二向色鏡起分光作用。選擇分光波長為350 nm的二向色鏡，小于350 nm的波長將發生反射，大于350 nm的波長將透過。在此光路中二向色鏡可將紫外激發光反射，將紅色熒光透射；透鏡L3對紫外激發光的聚焦作用。其焦距為[f3，]L2，L3兩塊透鏡構成一個比例成像光路，該光路的放大比例[K]由L2，L3的焦距決定，即[K=f3f2。]選擇合適焦距的透鏡，便可得到所需的光斑大小。同時，在熒光收集光路中透鏡L3起聚光及準直的作用。L3與L4也在熒光收集光路中構成一個比例成像光路。

2.3 光電轉換單元

2.3.1 光電轉換器件的選取

圖像采集單元的主要作用是將熒光收集光路所采集到的光信號轉換為電信號。儀器要求光電轉換單元擁有較高的靈敏度及一定的空間分辨率，因此選用東芝的TCD256ED線陣CCD作為光電轉換單元，該線陣CCD具有以下特點：具有256個像素，有效長度為4.8 mm，每個像元的尺寸為18 μm×18 μm，像元尺寸較大，適合弱光檢測；光譜響應的峰值為560 nm，615 nm波長光的相對敏感度大于90%，因此對收集的熒光可高效地進行光電轉換；質控帶及檢測帶大小約4 mm×4 mm，而線陣CCD的有效成像長度為4.8 mm，因此上述熒光收集光路采用1∶1的比例成像光路。

2.3.2 線陣CCD的驅動及數據采集模塊

采用三星公司生產的ARM9芯片S3C2440作為主控芯片，對數據進行采集及處理，采用CPLD產生脈沖信號作為線陣CCD的驅動，原理圖如圖5所示。

圖5 線陣CCD的驅動模塊及圖像采集模塊

數據采集以幀為單位進行。單幀讀入及處理過程如下[7?9]：S3C2440接收到鍵盤輸入的采集信號時，S3C2440發送幀啟動脈沖給CPLD；CPLD接收到幀啟動脈沖信號，產生線陣CCD驅動信號和A/D轉換器的采樣信號，使CCD與A/D轉換器開始工作；從線陣CCD出來的模擬信號較微弱，經放大電路放大后，通過8位精度的A/D轉換電路轉換為數字信號；從A/D出來的數字信號存入SRAM；一幀圖像采集完畢，發送INT信號給S3C2440，S3C2440讀取SRAM，處理信號。

線陣CCD驅動電路是使用硬件描述語言在CPLD（可編程邏輯器件）內部產生滿足驅動時序要求的脈沖信號。驅動東芝TCD1024ED線陣CCD共需要5路驅動信號[5]，分別為：光積分脈沖SH，兩相電荷轉移脈沖P1、P2，復位信號RS，鉗位信號CP，五個驅動信號只有彼此之間滿足一定的時序和相位關系，X1024A才能正常工作。驅動電路原理如圖6所示[10?11]。

圖6 線陣CCD驅動原理圖

由于CPLD輸出3.3 V的電平，而CCD需要5 V的驅動電壓，因此采用TI公司生產的帶三態輸出的、8位電平轉換芯片SN74ALVC4245，進行3.3 V電壓向5 V電壓的轉換。

由于熒光比較微弱，在編寫驅動時，可以通過延長積分時間，使每個CCD像元可以累積更多的電荷，提高系統檢測弱光的能力。

2.4 信號處理及輸出單元

S3C2440同時作為信號的采集芯片及處理芯片。信號處理流程圖如圖7所示。

圖7 信號處理流程圖

2.5 系統標定

數據經ARM9處理后，得到檢測帶與質控帶熒光發射密度的比值。采用實驗的方法對儀器進行標定，建立檢測結果與心肌標志物濃度的對應關系，通過曲線擬合的方法，得到熒光密度比與心肌標志物濃度的關系曲線，如圖8所示，從而得到二者一一對應關系的數學模型。由檢測得到的熒光比值便可確定出心肌標志物的濃度。

圖8 熒光發射密度比值與心肌標志物濃度的對應關系曲線

3 實驗結果及分析

本文采用福建泰普生物科學有限公司的熒光免疫層析試條以及廈門大學醫學院提供的心肌標志物標準品，并將所述標準品稀釋成400 mIU/mL，350 mIU/mL，300 mIU/mL，250 mIU/mL，200 mIU/mL，100 mIU/mL等不同等級濃度的標準試液。取等量的試液分別滴加在試條上，并連續對每個試條進行3次測量，測試結果見表1。

表1 實驗結果

[標準樣品濃度 /（mIU/mL）＼儀器測出濃度 /（mIU/mL）＼相對誤差

/%＼第一次

測量＼第二次

測量＼第三次

測量＼平均值＼400＼388＼389＼388＼388.3＼2.93＼350＼340＼340＼341＼340.3＼2.77＼300＼292＼293＼293＼292.6＼2.47＼250＼244＼244＼244＼244.0＼2.36＼200＼195＼197＼197＼195.7＼2.15＼100＼98＼99＼98＼98.6＼1.4＼]

由表1可知，隨著標志物濃度的增強，儀器檢測的相對誤差增大，通常AMI患者心肌標志物的濃度小于350 mIU/mL，因此該儀器的測量誤差小于2.77%，滿足臨床檢測的要求。

4 結 語

本文采用線陣CCD對熒光信號進行定量檢測，設計了高效的紫外聚焦光路、熒光收集光路，采用CPLD產生5路脈沖對線陣CCD進行驅動，并且采用ARM9處理器采集及處理數據。最后通過系統標定，實現了樣品中特定心肌標志物濃度的定量檢測，為醫學診斷提供了科學的依據。

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