多靶標生物標志物檢測的微流體磁敏生物傳感器研制

摘 要：將磁敏傳感器與微流體測試卡集成，研制了可快速檢測多靶標生物標志物的微流體免疫磁敏傳感器。以3種消化系統腫瘤標志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、糖鏈抗原）為模型靶標，對免疫反應各步反應的液體流速、免疫反應時間以及反應后的沖洗速度進行了優化，評價了多靶標同時檢測的系統性能。在微流體磁敏生物傳感器系統中，建立了血清樣本中3種靶標同時檢測的標準工作曲線，AFP、CEA和CA19-9的檢出限分別達到0.1 μg/L、0.1 μg/L和30 U/mL，線性范圍跨越4個數量級。微流體磁敏生物傳感器可在30 min內完成多靶標生物標志物檢測，臨床血清樣本的測試結果與ELISA法一致，具有檢測時間短、靈敏度高的優點。

關鍵詞：微流體； 磁敏傳感器； 多靶標生物標志物

1 引 言

近年來，微流體技術（Microfluidics technology）快速發展^[1，2]，已在化學、醫藥及生命科學等領域引起廣泛關注。微流體芯片，又稱為“芯片實驗室”（Lab-on-a-chip）^[3]，利用微機電技術將一般實驗室所使用的分離、反應、混合等裝置微小化到芯片上，以進行生化反應、分析，可以對微量流體進行復雜、精確的操作，因其具有體積輕巧、使用樣品和試劑量少、反應速度快、平行處理大量樣品等優點^[4～6]，在生物分析技術領域廣泛應用^[7～9]。

生物傳感器技術^[10～12]作為生物分析技術中的一個重要分支，結合了生命科學、分析化學、物理學、計算機信息科學等相關技術，能夠對待檢物質進行快速分析，在醫療檢測、環境監測、食品安全、軍事安全等領域有廣泛的應用。其中， 磁隧道結（Magnetic tunnel junction，MTJ）傳感器^[10～16]是一種利用巨磁阻效應的新型生物傳感器，以超順磁顆粒為檢測探針，具有體積小、成本低、生物背景低、靈敏度高、高通量等特點，有望為生物學^[10～14]、藥學研究^[15]、醫學檢驗^[16]等領域提供便攜、快捷的新技術平臺。

腫瘤標志物是指在腫瘤的發生和增殖過程中，由腫瘤細胞本身所產生或由機體對腫瘤細胞反應而產生的，反映腫瘤存在種生長的一類物質。多種腫瘤標志物的聯合檢測能夠提高診斷的準確性，上廣泛應用于不同類型腫瘤的早期發現和診療^[17～20]。目前的腫瘤標志物檢測方法主要有酶聯免疫分析法（ELISA）、放射免疫分析法、熒光免疫分析法和膠體金試紙條檢測等，這些方法多是針對單個標志物的單靶標測試，且耗時長，操作較復雜。結合微流體技術檢測體系，可以提高自動化程度；磁敏傳感器檢測技術，可以進行高靈敏度、高通量、多靶標的快速測試，可以為腫瘤標志物的聯合檢測提供高效的檢測方法。

本研究以磁敏傳感器為平臺，設計并建立研制了一種芯片上的微流體磁敏生物傳感器，評價了基于磁敏傳感器的消化系統腫瘤標志物多靶標定量檢測的可行性。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

磁敏傳感器檢測儀樣機及配套磁敏傳感器測試卡（40 mm × 50 mm）由東莞博識生物科技有限公司與中國科學院理化技術研究所聯合研制；MTJ傳感器陣列（6.6 mm×10.7 mm×0.75 mm，Magic Technologies， US）；DZF-6020型真空干燥箱；L0107-1A注射泵（保定蘭格恒流泵有限公司）；BX51熒光顯微鏡（Olympus公司）；EASY pure LF 超純水系統（美國Barnstead 公司）。

甲胎蛋白（AFP）抗原標準品、癌胚抗原（CEA）標準品、糖鏈抗原（CA19-9）標準品、抗AFP包被抗體、抗CEA包被抗體、抗CA19-9包被抗體、Biotin標記抗AFP抗體、Biotin標記抗CEA抗體、Biotin標記抗CA19-9抗體（美國Fitzgerald Industries International公司）；牛血清白蛋白（BSA，北京欣經科生物技術公司）；優級純胎牛血清（北京欣經科生物技術公司）；親和素-超順磁顆粒（Avidin-beads，法國Ademtech公司）；3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷（GPTS，97%，美國Alfa Aesar公司）；Na2HPO4， KH2PO4， Na2CO3和NaHCO3（美國Merck公司）；實驗用水均為超純水。

2.2 磁敏傳感器免疫測試原理

磁敏傳感器是以超順磁顆粒作為探針，通過MTJ傳感器陣列芯片對生物分子捕捉到的超順磁顆粒的響應，實現對芯片表面的生物分子進行分析檢測。在外加磁場作用下，超順磁顆粒被磁化、產生磁場（圖1），磁顆粒產生的磁場干擾下方的MTJ傳感器，使其產生電阻率變化、進面轉化為電流信號變化，即得到磁顆粒數目的信號^[16]。腫瘤標志物的檢測是使用夾心免疫反應原理，芯片表面的第一抗體（1st Antibody）、血樣中的抗原（Antigen）與生物素修飾的第二抗體（2nd Antibody-Biotin）通過特異的免疫反應，形成夾心結構；超順磁顆粒（Avidin-Bead）上的親和素與第二抗體的生物素結合，從而被捕獲到芯片表面；當施加微弱磁場時， MTJ傳感器感應到磁顆粒，產生電流信號，信號大小可以反映出樣品中的抗原濃度，以達到定量檢測樣品中靶標分子的目的。

2.3 微流體磁敏生物傳感器測試卡的設計

將修飾了特定抗體的磁敏傳感器集成到微流體測試卡內，實現程序化進樣、反應、分離和測試。如圖2A所示，整個測試卡是由樣品舟（Cartridge）、微通道層（PDMS layer）和芯片印制電路板（Printed circuit board with MTJ chip，PCB with MTJ chip）三層結構構成。樣品舟上共有4個液體注入口，分別為待檢測樣品（Sample）、清洗液（Rinsing buffer）、生物素修飾的第二抗體（2nd Antibody-biotin）和親和素-磁顆粒（Avidin-beads）。在PDMS層上設計有液體流動的微通道，進樣口內的液體在微量注射泵的驅動下，依次從不同的進樣口流經芯片的點樣區進入廢液池，圖2B展示的是測試卡中微流體通道的平面圖。在芯片上不同區域包被不同抗體，可以達到多靶標同時測試的目的。

[TS（][HT5”SS]圖2 MTJ生物傳感器的測試卡設計簡圖（A）和微流體通道示意圖（B）

Fig.2 Design sketch of MTJ biosensor test card （A） and fluidic channel（B）[HT5][TS）]

2.4 實驗步驟

2.4.1 緩沖溶液及稀釋液的配制 磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 7.4）：以KH2PO4和Na2HPO4配制，并用H3PO4和NaOH溶液調節至pH 7.4。包被緩沖液為0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）。0.1% BSA-PBST溶液為清洗液、Antibody-Biotin及Avidin-Beads的稀釋液，1% BSA-PBST作為封閉液。標準溶液的配制： 取適量抗原標準品，用胎牛血清稀釋至特定濃度使用。以上所有溶液均加入0.04% NaN3，于4 ℃保存。

2.4.2 免疫分析過程 全部反應過程在室溫下進行。在3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷處理的芯片表面，用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液制備的濃度為20 mg/L的AFP， CEA， CA19-9抗體包被溶液及BSA溶液，分別取500 nL 滴加在芯片測試區域^[21]，在濕度為90%的環境中溫育10 min；加入1% BSA-PBST封閉液，5 min后將芯片裝入測試卡，向測試卡中注入40 μL待測樣品，室溫下樣品中抗原與固定抗體反應一定時間后，用清洗液沖洗，除去游離的抗原；再注入40 μL混合標記抗體-生物素，室溫下反應一定時間后，注入80 μL清洗液； 然后注入40 μL親和素-磁顆粒，反應一定時間； 最后注入80 μL 清洗液沖洗，去除未反應的磁顆粒；將測試卡載入傳感器中讀出磁顆粒數目，并計算出磁顆粒數目與樣品中抗原含量的相關性。

3 結果與討論

3.1 分析條件的優化

微流體系統中免疫反應的效率受到微通道的液體流速、芯片上的表面張力等因素的影響很大。實驗中通過注射泵在微流體通道中依次注入反應液和清洗液，從而實現微流體中的免疫反應和沖洗過程。分析條件的優化，主要是篩選反應試劑的注入速度、免疫反應時間以及芯片表面的沖洗條件。由于儲液室的體積固定，因此對注入速度和沖洗速度的篩選也就是對試劑注入時間和清洗液注入時間的篩選。對3種腫瘤標志物分別進行了篩選，這里僅列出CEA分析條件的篩選過程。

設定緩和的微流體條件和較充分的反應時間（每步15 min），篩選出最佳標記抗體和磁顆粒溶液的濃度分別為20 μg/mL和1 mg/mL（10倍稀釋）。在設定清洗液體積為80 μL的條件下，改變清洗液注入時間，研究沖洗速度對特異反應（抗原為1 μg/L）和非特異吸附（抗原為0）的影響。如圖3A所示，非特異吸附的磁顆粒數目隨沖洗時間的縮短而略有降低，特異反應的磁顆粒數目隨沖洗時間的縮短而降低，為了獲得最高的信噪比，最優的沖洗條件為在60 s內注入80 μL清洗液。

芯片表面的免疫反應如圖1所示，血樣中的抗原與芯片上的包被抗體的結合，直接影響最終的免疫夾心結構的形成，因此抗原溶液的靜置時間，對腫瘤標志物的免疫分析有直接而重要的影響。實驗中篩選了含有CEA抗原的血樣的靜置反應時間（圖3B），在1 μg/L抗原濃度下，隨靜置反應時間延長，反應區檢測到的磁顆粒數目增加，10 min后增加幅度變小，基本達到平衡。對標記抗體和磁顆粒溶液的靜態反應時間進行了篩選，由于二者的使用濃度較高，所以反應在5 min左右基本達到飽和。由此確定了腫瘤標志物免疫分析中三步免疫反應的時間分別為10， 5和5 min。[TS（][HT5”SS]圖3 沖洗時間和樣品靜態反應時間的篩選

Fig.3 Optimization of the rinsing time （A） and static reaction time （B） for carcino-embryonic antigen （CEA）[HT5][TS）]

在微流體傳感器體系中分別篩選了AFP， CEA和CA19-9的測試條件，3種腫瘤標志物的最佳反應時間相近，最佳沖洗條件略有差別（表1），故多靶標聯合檢測中選擇60 s作為最佳沖洗時間，使用微流體磁敏生物傳感器，可以在30 min內同時進行3種腫瘤標志物的檢測。