超聲萃取—同位素稀釋液相色譜—質譜法檢測血清中氫化可的松

摘 要：建立了液相色譜-質譜檢測血清中氫化可的松含量的方法。血清加內標后平衡30 min，加乙腈除蛋白，將混合液超聲10 min，再以3000 r/min離心15 min，取出上清液用氮氣吹干，用水復溶后，以相同體積乙酸乙酯萃取兩次，將兩次萃取的乙酸乙酯合并，氮氣吹干，然后用200 μL流動相復溶，液相分離采用Zorbax Eclipse Plus C18 色譜柱，流動相為甲醇和含0.1%甲酸的水溶液（43∶57， V/V），日間和日內標準偏差分別為0.3%～0.7%和0.3%～0.6%，回收率為99.6%～101.0%，定量限為1.68 μg/kg。運用本方法檢測了3種人體血清中氫化可的松含量，并研究了血清中氫化可的松的穩定性。

關鍵詞：氫化可的松； 同位素稀釋； 液相色譜-質譜； 超聲萃取； 血清

1 引 言

氫化可的松是一種重要的腎上腺皮質激素^[1]，在體液循環中大部分與蛋白質鍵合。其主要參與碳水化合物代謝，具有阻礙周圍組織中蛋白質合成和促進免疫力的功能^[2]，同時參與控制人體新陳代謝速率和個體生長。異常的氫化可的松含量會導致多種疾病，比如阿狄森氏病、庫氏綜合癥和糖尿病等^[3]。因此準確測量血清中氫化可的松含量對于監測甾體激素的產生過程和人體健康有重要意義。

關于血清中氫化可的松檢測的方法很多，早期主要采用免疫分析法^[4，5]，但測量結果假陽性偏多^[6]。近年，大量關于使用液相色譜（LC）^[7～9]，氣相色譜-質譜（GC-MS）^[10，11]和液相色譜-質譜（LC-MS）^[12，13]的分析方法多有報道。多運用固相萃取（SPE）去除蛋白，分離血清中目標物，取得了一定的效果，但是這些方法往往前處理時間較長，實驗消耗昂貴，而且需要較高的實驗技巧。為了解決這些缺點，本研究采用超聲結合乙酸乙酯液液萃取的方法分離血清中氫化可的松。超聲波是一種特殊形式的能量，其在溶液中產生的沖擊波和微熱流能顯著增加待分析物的活性，多用于藥物分析，但用于血清中激素的分析還未見報道。同位素稀釋質譜法是指將目標物的同位素標記加入待測樣品中，與目標物充分混合，通過加入的標記的量及質譜檢測的目標物及其同位素標記的豐度比來計算目標物含量的方法。在目標物與其同位素標記達到平衡后，同位素的豐度比既已恒定，混合后的樣品在進行元素分離、濃縮、轉移、萃取等操作過程中，即使發生丟失，也不會改變同位素組成，避免了由此帶來的測量誤差。本實驗表明，超聲萃取可增加氫化可的松從蛋白和血清中分離效果，使用超聲波結合液液萃取，大大降低了實驗消耗，縮短了前處理時間，經過同位素稀釋，進行液相色譜質譜分析，方法準確可靠。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

6410三重串聯四極桿質譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；氮吹儀（美國Organomation公司）；Mill-Q Academic純水處理系統（法國Milli Pore公司）；CP324S電子天平（德國Sartorius 公司）；臺式高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；Touch Mixer MT-51渦旋振蕩器（日本Yamato公司）；Branson 5510超聲波清洗機（美國Branson 公司）。

2.2 液相色譜條件及質譜條件

2.2.1 液相色譜條件 安捷倫1200高效液相色譜儀，Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱（150 mm×2.1 mm i.d.， 3.5 μm）；流動相A為甲醇，流動相B為0.1%甲酸溶液，兩相比例為43∶57；柱溫：25 ℃；樣品盤溫度：4 ℃；流速為0.25 mL/min。

2.2.2 質譜條件 安捷倫6410三重串聯四極桿質譜儀，ESI源，正離子模式。其它質譜參數：干燥氣流速12 L/min、噴霧電壓413.7 kPa、毛細管電壓3500 V、碰撞能10 V、碎裂電壓130 V。整個質譜檢測時間6 min，溶劑延遲1 min。

2.3 實驗方法

2.3.2 血清樣品的處理 將200μL血清加入1 mL安培瓶內，并稱量血清質量，加入適量的氫化可的松同位素標記的工作標準溶液，并稱量其質量。加標血清在常溫下平衡30 min后，加入400 μL乙腈除蛋白，將混合液在超聲機上超聲10 min，再以3000 r/min離心15 min，取出上清液在40 ℃水浴下氮氣吹干，用200 μL水復溶后，以相同體積乙酸乙酯萃取兩次，將兩次萃取液合并，在40 ℃下氮氣吹干。然后用200 μL流動相復溶，充分渦旋以保證完全溶解。所有復溶液在用LC-MS/MS分析前都要經過0.22 μm 濾膜過濾，分析進樣量為10 μL。

3 結果與討論

3.1 萃取條件的優化本實驗中，對平衡時間和超聲時間進行了優化。如圖1所示，最優平衡時間為30 min，最優超聲時間為10 min。實驗還發現，吹干的血清在用乙酸乙酯萃取前，先用水復溶，可以有效除去很多水溶性雜質。當用乙酸乙酯萃取兩次后，氫化可的松基本萃取完全。

3.2 質譜條件優化

注入10 μL 100.5 μg/kg氫化可的松標準溶液進行LC-MS/MS質譜條件的優化。全掃描模式下，用ESI源在正離子和負離子模式分別進行掃描，以確定分子離子峰和合適的電離方式。結果表明，正離子模式下有更好的離子響應，這可能是氫化可的松化學結構中由于含有2個酮基和3個羥基，易于吸收質子形成穩定的[M+H]+ 準分子離子，所以選擇正離子模式，采用ESI源。全掃描模式下確定了氫化可的松標準和標記的母離子，在選擇離子檢測模式下以氮氣為碰撞氣體，對母離子進行碰撞誘導解離（CID），確定響應最高的子離子。在確定了母離子和子離子的條件下，采用LC-MS/MS的選擇離子檢測模式（MRM）進行進一步優化，對碰撞能（Fragmentor）和碎裂電壓（CE）分別進行優化，以保證得到的子離子有最大離子響應。圖2和圖3是實驗所得全掃描質譜圖和MRM模式下子離子質譜圖，通過圖2可以得到氫化可的松標準的母離子為m/z 363.20，標記的母離子為m/z 367.20，圖3顯示出氫化可的松標準和標記豐度最大的子離子分別是m/z 327.2和331.2，由兩圖確定了MRM模式下氫化可的松標準的離子對為： m/z 363.20/327.2， 氫化可的松標記的離子對為m/z 367.20/331.2，圖4是血清樣品中氫化可的松標準的色譜圖。由圖4可見，優化質譜條件可以大大提高質譜對氫化可的松的響應，色譜圖顯示沒有相似物峰干擾定量分析，說明前處理條件較合適。

3.3 方法確證實驗

為了評估本方法的準確性，實驗選取由美國NIST提供的CCQM-K63a比對樣品作為質控樣品。有關CCQM-K63a結果本實驗室已有報道^[14]，但是當時所用的方法需要對血清磷酸化和過SPE柱，本實驗采用超聲結合乙酸乙酯液液萃取的方法，提高了實驗效率，減少前處理時間，節約了成本，檢測結果準確，不確定度大大降低。實驗結果如圖5所示。其中，韓國標準研究所（KRISS）、英國政府化學實驗室（LGC）、中國計量院（采用SPE前處理，NIM-SPE）、本實驗（采用超聲結合乙酸乙酯液液萃取，NIM-ULE）、美國標準研究院（NIST）、日本計量研究實驗室（NMIJ）、德國物理技術研究室（PTB）測定結果分別為101.66， 101.40， 100.46， 100.49， 100.48， 98.47和101.31 μg/kg，不確定度分別為1.02， 1.50， 0.91， 0.78， 1.07， 1.06和0.97 μg/kg。

3.4 方法精密度、回收率和定量限

通過對3種不同含量（80.7， 105.4和165.2 μg/kg）血清樣品重復測定，檢驗本方法的精密度，日內和日間含量測定值的精密度如表1所示。同時，通過加標實驗測定方法的回收率，如表2所示。通過質譜自帶數據處理軟件計算出不同含量血清氫化可的松樣品的信噪比，定量檢出限（10倍信噪比）為1.68 μg/kg。

3.5 血清氫化可的松含量穩定性實驗

通過測定3個含量的自制樣品，判斷血清中氫化可的松在不同保存條件下的穩定性。結果表明，直接融化和在室溫下保持24 h的血清中氫化可的松含量無明顯不同。一次融化復凍循環并無導致血清中氫化可的松含量減少，而在室溫下保持48 h和融化復凍兩次后，會導致血清中氫化可的松含量測定值略有（<0.5%）降低，而且實驗數據的不確定度也有所增加。

3.6 不同人體血清氫化可的松含量測定

在血清標準物質的制備過程中，必須保證血清中氫化可的松含量穩定，因此，將血清按照男性健康人，男性腎病病人，女性健康人分類，并分別混勻。運用本方法對其中的氫化可的松含量分別測定，得到如下結果：男性健康人、男性腎病病人和女性健康人中血清氫化可的松含量分別為100.6， 169.5和82.2 μg/kg，不確定度分別為0.60， 0.85和0.33 μg/kg。

4 結 論

本實驗采用超聲結合乙酸乙酯液液萃取的高準確度同位素稀釋液相色譜-質譜方法檢測血清中氫化可的松含量，靈敏度高，分析時間短，樣品前處理步驟簡單，消耗少。本方法的準確度優于文獻記載的其它常規方法，為血清中氫化可的松成分分析標準物質研制奠定了基礎。