基于¹H NMR的代謝組學方法對大鼠砒霜給藥后血清的研究

摘 要：運用代謝組學方法研究了Wistar大鼠灌胃給藥砒霜2和10 mg/kg劑量血清代謝的變化。通過核磁共振技術檢測大鼠血清的代謝指紋圖譜，然后利用主成分分析法分析空白組和砒霜給藥組的代謝物差異，研究不同劑量砒霜在大鼠體內的急性生物效應。結果表明，砒霜對大鼠的急性靶向器官是肝臟，隨著劑量增大，毒性增強；低劑量給藥導致氧化應激，高劑量給藥誘導細胞凋亡；低和高劑量給藥均出現糖、氨基酸及脂質代謝紊亂，且能量代謝異常。

關鍵詞：代謝組學； 砒霜； 核磁共振； 血清； 主成分分析

1 引 言

1999年，Nicholson等提出代謝組學（Metabonomics）的概念，并將其定義為：對生物系統因病理生理或基因改變等刺激所致動態多參數代謝應答的定量測定^[1]。如今，代謝組學已應用于疾病診斷、藥物毒性、營養學等多個領域^[2～5]。代謝組學方法主要利用現代分析技術如GC-MS， LC-MS， HR MAS和1H NMR等，結合模式識別方法，對生物體液和組織進行系統檢測和分析，從而得到生物體代謝物濃度隨時間變化的信息^[6，7]。

砒霜為臨床上應用廣泛的礦物藥，主要成分是As2O3及一些礦物質，主要用于治療寒痰哮喘、瘧疾、梅毒和痔瘡等疾病。但研究表明，砒霜既能治療急性早幼粒細胞白血病^[8]，又能誘導體內外的腫瘤細胞株凋亡^[9，10]；同時，As2O3是一個活性很高的分子，能與很多蛋白的巰基結合，對線粒體產生毒性作用，消除細胞膜電位，產生活性氧物質（Reactive oxygen species， ROS）^[11]。砒霜進入人體后能破壞某些細胞呼吸酶，強烈刺激胃腸粘膜、破壞肝臟，嚴重的會導致呼吸和循環衰竭。As被認為是毒性物質和致癌物，但對其毒性評價還不完全。主成分分析是毒性評價中常用的模式識別方法之一，利用它對體液1H NMR譜圖數據進行處理和分析，能得到有價值的生物信息。本研究利用主成分分析法和基于1H NMR 的代謝組學方法^[12]，從分子水平對砒霜毒性和毒性作用機制進行研究。

3 結果與討論

3.1 血清的1H NMR譜圖及多元統計分析

血清的組成均一性高，幾乎含有血液中所有的小分子化合物，通過CPMG序列得到的譜圖，可以減弱生物大分子產生的譜線變寬的干擾，進而更好地研究血清中代謝物濃度變化過程。圖1為砒霜2和10 mg/kg劑量給藥48 h后及對照樣本血清的1H NMR譜圖譜峰，參考文獻[13，14]進行譜峰歸屬。

低劑量破壞了大鼠的能量代謝，葡萄糖能夠快速補充能量，葡萄糖升高說明砒霜抑制了機體能量代謝，肌酸與磷酸結合生成磷酸肌酸，迅速補充ATP在血液中的含量，血清中較低濃度的肌酸，說明肌肉能量代謝過程可能受到抑制。低劑量的葡萄糖升高也與葡萄糖有氧糖代謝受阻有關。丙酮酸可通過糖異生作用生成葡萄糖，也可由糖酵解途徑生成，丙酮酸升高與糖代謝異常相關。低劑量氨基酸代謝紊亂，谷氨酰胺（Gln）是體內含量最豐富的非必需氨基酸，約占體內總游離氨基酸的50%，Gln的變化直接影響機體總氨基酸的代謝，N-乙酰基糖蛋白、異亮氨酸和丙氨酸濃度的變化，同樣反映了氨基酸代謝紊亂。砒霜中的砷為一種細胞原漿毒，進入機體后與細胞酶系統中的巰基結合，形成穩定的巰基化合物，本研究出現了糖及氨基酸代謝發生紊亂，可能與糖和氨基酸代謝的酶系統破壞有關。

3.2.2 高劑量組給藥代謝學分析 通過圖3可以找出高劑量給藥后48 h的生物標記物：濃度升高的代謝物有LDL、 VLDL、NAC2、脂質、不飽和脂質；濃度降低的代謝物有纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、乙酸、NAC1、丙酮酸、谷氨酰胺、肌酸、膽堿、TMAO、甘油磷脂酰膽堿、葡萄糖、乳酸。

高劑量砒霜給藥48和96 h后，在大鼠血清1H NMR譜中均觀察到脂類及脂蛋白信號增強，這與脂代謝異常有關。Wei等^[18]研究雄黃 （As4S4） 給藥后大鼠血清的1H NMR譜時，發現脂類及脂蛋白信號峰增強，說明雄黃會誘導細胞的凋亡。本實驗也出現了脂類及脂蛋白信號峰增強現象，表明高劑量砒霜同樣會誘導細胞凋亡，與As2O3主要是通過誘導白血病細胞分化和促使其凋亡而發揮治療作用^[19]相同。

膽堿是體內重要的甲基供體，無機砷進入大多數哺乳動物體內后，其代謝過程涉及一系列甲基化反應。通過S-腺苷蛋氨酸（S-Adenosglmethiomine， SAM）提供甲基官能團給砷，生成胂酸和二甲胂酸，并隨尿排出體外，此過程是砷的主要代謝途徑^[20，21]。本研究中高劑量組血清中膽堿降低，說明了高劑量砷在血清中發生了甲基化反應。

高劑量組中還觀察到葡萄糖及氨基酸（丙氨酸、谷氨酰胺）代謝紊亂，表明As（Ⅲ）進入機體后與細胞酶系統中的巰基結合，形成穩定的巰基化合物。

肝臟具有代謝功能，糖、氨基酸及脂的代謝過程與其相關。本研究的低、高劑量組均發生肝臟代謝功能異常，對肝臟造成損傷。TMAO降低是肝臟受損的標志，在高劑量組中TMAO濃度變化，在低劑量組中濃度未發生變化，表明高劑量給藥組比低劑量給藥組對肝臟的損傷更嚴重。

乙酸是短鏈脂肪酸氧化的一個產物：乙酰乙酸+乙酰輔酶A→乙酰乙酰輔酶A+乙酸，高劑量血清中的乙酸濃度降低表明肝臟線粒體中進行的脂代謝發生紊亂，但是在低劑量組中肝臟線粒體的脂肪代謝未出現異常。

1927年，Warburg等^[22]發現癌細胞的能量代謝異常，即在有氧環境下，癌細胞優先進行糖酵解，并產生大量的乳酸，稱之為“有氧糖酵解”，亦稱為“Warburg效應”，被認為是癌細胞所具有的普遍特征。本研究觀察到乳酸濃度升高，是否與砒霜致癌有關，需要進一步研究，但低、高劑量砒霜均造成能量代謝異常。

本研究表明，低劑量給藥導致細胞氧化應激機制，而高劑量給藥誘導細胞凋亡。高劑量給藥對大鼠造成的肝臟損傷較低劑量嚴重，低、高劑量給藥后均出現糖、氨基酸、脂代謝及能量代謝異常。低、高劑量給藥48 h后對大鼠造成的毒性達到最大，給藥168 h后對大鼠毒性作用恢復至給藥前，表明低、高劑量砒霜給藥的急性毒性作用是可恢復的，為砒霜的合理利用提供依據。