脂質組學血清樣品處理方法及其快速高分辨液相色譜—質譜分析

摘 要：通過系統考察血清樣本前處理方法、優化液相色譜條件及質譜檢測參數，建立了脂質組學血清樣本前處理及其快速高分辨液相色譜-質譜（RRLC-MS）分析方法。血清樣本中加入二氯甲烷-甲醇（CH2Cl2-CH3OH，2∶1， V/V）混合溶劑進行脂質提取，采用ACQUITY UPLC CSH C18色譜柱（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm），以10 mmol/L 甲酸銨溶液（含0.1% 甲酸）為流動相A，乙腈-異丙醇（1∶1， V/V）為流動相B，梯度洗脫，采用正負離子檢測模式電噴霧電離（±）ESI、正離子檢測模式大氣壓化學電離 （+）APCI方式進行質譜檢測。對血清中脂肪酸、甘油脂、鞘磷脂、甘油磷脂和膽固醇（酯）5類14種代表性脂質類成分進行了方法學考察。結果表明，方法靈敏度高、精密度及穩定性良好。對穿插在檢測序列中的質控樣本檢測結果進行主成分分析（PCA），證明了本方法獲得數據的可靠性良好，適用于脂質組學研究。

關鍵詞：脂質組學； 血清前處理方法； 液相色譜-質譜

1 引 言

隨著20世紀系統生物學的興起，在代謝組學的基礎上，2003年脂質組學研究正式被提出^[1]，并被應用于疾病診斷、藥物開發等領域的研究^[2]。在脂質組學研究中，從生物樣本中提取脂質類成分的完整性對脂質組學分析方法有非常重要的意義。傳統“金標準”法即“Folch or bligh and dyer recipes”法（采用CHCl3-CH3OH（2∶1， V/V）混合溶劑）是目前最常用的脂質類成分提取方法^[3～5]。然而氯仿具有致癌性^[6]，且氯仿降解后產生光氣、氯化氫氣體，可能使不穩定的脂質類成分發生化學修飾^[7]，影響脂質組學分析測定的準確性。目前文獻報道了改進的二氯甲烷-甲醇（CH2Cl2-CH3OH）提取法^[8]和甲基叔丁基醚-甲醇（MTBE-CH3OH）提取法^[9]以及兩種方法分別與金標準方法的對比研究^[9～11]。但是未見對3種提取方法的系統比較，文獻報道的脂質組學分析方法中未見關于樣本穩定性的考察研究^{[8，12，13]}。本研究采用（±）ESI、（+）APCI相結合的RRLC-MS技術，可以獲得含有更全面質譜信息的脂質組學數據。選取血清中14種代表性脂質類成分，系統考察了脂質類成分的提取方法，并對分析過程中涉及到的處理前、處理過程中及處理后的血清樣本在不同放置條件及存放時間進行穩定性考察與驗證，旨在排除外界因素對測定結果的影響，保證分析結果的客觀性^[14～16]。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Agilent 1200系列快速高分辨液相色譜儀（德國Waldbronn Aglient technologies 公司）；QTRAPTM5500型四極桿-線性離子阱串聯質譜儀（美國Applied Biosystems/MDS SCIEX公司），配有ESI源、APCI源及Analyst 1.5.1數據處理系統。

脂質類成分標準品的信息見表1（依據網站Lipid Maps（http：//www.lipidmaps.org） 命名），甲酸銨（色譜純）均購自美國Sigma-Aldric公司。乙腈、異丙醇和甲酸（色譜純，Merck公司）。實驗用水為某品牌純凈水。

2.3 脂質類成分標準品及血清樣本的制備

（1）脂質類成分標準品混合液：稱取14種脂質類成分標準品適量，分別溶于CH2Cl2-CH3OH（2∶1， V/V）混合溶劑，制備標準品貯備液，SM（d18∶1/16∶0）和PE（14∶0/14∶0）濃度為0.1 mg/mL； PC（18∶1/18∶1）、PC（18∶1/0∶0）和CE（9∶0）濃度為0.5 mg/mL；Chol.濃度為10 mg/mL；其余均為1.0 mg/mL。取不同體積的14種脂質類成分標準品貯備液，混勻后稀釋至1 mL，所有脂質類成分的濃度按其在人體血液中的正常濃度配制（少數成分除外，各脂質類成分在人體血液中的正常濃度范圍均由網站HMDB（http：//www.hmdb.ca）獲得），記為Mixture 1。將Mixture 1進行10倍、20倍稀釋，即人體血液正常濃度的1/10和1/20倍，分別記為Mixture 2和Mixture 3。

（2）血清樣本：血清在4℃下解凍，取血清30 μL，加入CH2Cl2-CH3OH（2∶1， V/V）（含0.1 g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基酚，0℃）混合溶劑600 μL，渦旋并靜置，加入水200 μL，離心后移取有機相氮氣吹干，加入乙腈-異丙醇（CH3CN-IPA，1∶1， V/V）混合溶劑500 μL復溶，10000 r/min離心10 min后取上清進樣。30例健康人血清分別按以上方法處理后，各取10 μL合并混勻， 即得QC樣本。

2.4 數據處理

由RRLC-MS檢測獲得的QC樣本最初數據經過Wiff to mzData translator software （version 1.0.0.4， Applied Biosystems/MDS Sciex） 轉換成mzData格式。采用XCMS進行保留時間校準、峰識別、濾噪、峰匹配，獲得原始二維數據陣，進一步導入多變量統計軟件SIMCA-P software 12.0 （Umetrics AB， Ume， Sweden）進行PCA分析。

3 結果與討論

3.1 血清樣本前處理方法的建立

首先對血清樣本中脂質類成分的提取方法進行了系統考察。分別采用CHCl3-CH3OH（2∶1， V/V）、CH2Cl2-CH3OH（2∶1， V/V）、MTBE-CH3OH（4∶1， V/V）3種混合溶劑作為血清樣本中脂質類成分的提取溶劑，分別記為CHCl3-CH3OH法、CH2Cl2-CH3OH法、MTBE-CH3OH法，各平行3份。通過對脂質類成分的提取離子流色譜圖峰強度及相對標準偏差（RSD）的考察，分析比較了3種脂質類成分提取方法的提取效果，其結果見圖1及表2。對于FFA（16∶0）/10.07 min、FFA（18∶2）/7.89 min、PE（14∶0/14∶0）/17.13 min、PC（16∶0/0∶0）/3.71 min、PC（18∶1/0∶0）/4.43min、PC（18∶1/0∶0）/4.58 min、MG（18∶0/0∶0/0∶0）[rac]/10.59 min、Chol./18.1 min等脂質類成分，CH2Cl2-CH3OH法的提取離子流色譜圖峰強度高于或明顯高于CHCl3-CH3OH法，其它脂質類成分二者近似；對于FFA（18∶2）/7.89 min、PC（16∶0/0∶0）/3.71 min、PC（16∶0/0∶0）/4.37 min、PC（18∶1/0∶0）/4.58 min、Chol./18.1 min等脂質類成分，CH2Cl2-CH3OH法的提取離子流色譜圖峰強度高于或明顯高于MTBE-CH3OH法，其它脂質類成分二者近似。而且對于14種代表性脂質類成分，CH2Cl2-CH3OH法RSD小于或近似等于CHCl3-CH3OH法、MTBE-CH3OH法。綜上所述，CH2Cl2-CH3OH法對于脂質類成分的提取效果最優，且CH2Cl2的致癌性遠小于CHCl3 ，對實驗操作人員的安全性較高，因此最終采用CH2Cl2-CH3OH（2∶1， V/V）混合溶劑作為血清樣本中脂質類成分的提取溶劑。

3.4 數據可靠性分析

采用本方法對大批量血清樣本進行脂質組學分析，每分析10個血清樣本穿插1次QC樣本的檢測，以QC樣本的重現性監測分析系統的穩定性，以保證數據的可靠性。圖3是QC樣本的RRLC-MS譜檢測結果進行PCA分析后，各樣本在第一主成分上的投影結果，12次QC樣本的偏差均在2SD范圍內。結果表明，建立的RRLC-MS分析方法的穩定性良好，測試樣本之間的差異主要來自于樣品中內源性代謝物的差異，而不是由分析方法的誤差產生的，因此本研究獲得的檢測數據可靠、重復性好，能夠用于脂質組學研究。