3種芳香族氨基酸的液相色譜分析及用于胸腔積液病因鑒別診斷

摘 要：建立了一種同時測定人體胸腔積液中酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）和色氨酸（Trp）的液相色譜分析方法，并將其應用于胸腔積液病因鑒別診斷。優化的液相色譜條件如下： Vertex TM AQ-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-10 mmol/L醋酸銨緩沖溶液（醋酸調至pH 5.6）為流動相進行梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長為210和278 nm。結果表明，3種氨基酸在各自相應的線性范圍內線性相關系數均大于0.999； 信噪比為3時，檢出限（LOD）分別為0.50， 0.17和0.20 μmol/L。胸腔積液樣品經甲醇去除蛋白質后取上清液直接測定，3種氨基酸平均回收率在80.7%～101.1%之間，相對標準偏差為2.5%～8.7%。利用本方法對72例良惡性胸腔積液中的3種氨基酸進行分析，發現Tyr， Phe和Trp含量在不同疾病的樣品中存在統計學差異，對胸腔積液病因鑒別診斷有一定的臨床價值。

關鍵詞：高效液相色譜； 氨基酸； 胸腔積液； 鑒別診斷

1 引 言

肺癌的發病率和死亡率在我國和全球都位列第一。目前肺癌的發現和診斷主要依靠影像學檢查和組織病理活檢，但存在一定漏診和誤診，組織活檢具有創傷性。原有的肺癌標志物如癌胚抗原（CEA）、細胞角蛋白片段19（CK19）、神經烯醇酶（NSE）、鱗狀細胞癌相關抗原（SCC）等^[1，2]， 其特異及敏感性欠佳。因此開發新的、敏感性更高、特異性更強的潛在標志物對于肺癌的早期發現、病理分型、藥物干預治療等方面具有重要的指導意義。

芳香族氨基酸是指含有芳香環的氨基酸，如酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）和色氨酸（Trp），其代謝狀態對人體具有重要的生理和病理意義。Neurauter等^[3]利用高效液相色譜對卵巢癌患者的血漿進行分析，發現苯丙氨酸濃度顯著高于正常人。Cascino等^[4]研究發現血漿中游離氨基酸對不同腫瘤疾病具有不同的影響，肺癌患者較正常人的血漿中蘇氨酸、絲氨酸和甘氨酸含量明顯下降，色氨酸和谷氨酸明顯升高，而乳腺癌患者中鳥氨酸、谷氨酸和色氨酸有明顯增加。Deng等^[5]應用HPLC/MS技術對胃惡性腫瘤病人和正常人胃液進行了對比分析，發現胃惡性腫瘤胃液中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸含量明顯高于正常人。研究表明，在惡性腫瘤患者和正常人血清、胃液等體液中，Tyr， Phe和Trp的芳香族氨基酸有明顯區別，可以作為一種潛在的診斷標記物來篩選疾病。

目前，肺癌標記物主要研究對象集中在血清^[6，7]、尿液^[8，9]等體液以及各種組織^[10，11]。胸腔積液是肺部疾病最為特異的人體體液，是肺癌或其他肺部疾病（如肺炎、結核性胸膜炎等）的常見并發癥，是驗證疾病病因、判斷其良惡性的重要媒介之一^[12]。目前對于良惡性胸腔積液的病因鑒別診斷研究主要集中在蛋白質組學^[13，14]，而對于其中氨基酸類的小分子代謝物研究未見報道。胸腔積液中含有大量親水性物質，常規的反相和正相液相色譜未能將氨基酸和樣品中復雜基質實現有效分離，而利用親水作用機理來分析生物樣品得到極大關注。本研究建立了基于極性基團改性的C18柱的HPLC方法，對惡性胸腔積液（肺癌患者產生）和良性胸腔積液（肺部感染疾病產生）中Tyr、Phe和Trp進行檢測，并應用統計學方法探討其對肺癌輔助診斷及確定臨床病理分型的意義。

3 結果與討論

3.1 蛋白沉淀劑的選擇

在實驗中，采用甲醇和乙腈兩種常用的有機蛋白沉淀劑做了對比分析。對于同一份胸腔積液樣分別用這兩種溶劑進行沉淀蛋白，其余處理方法都相同。結果表明，經過高效液相色譜分析，甲醇除蛋白后得到的色譜圖上具有更多的峰和更高的峰強度。

3.2 色譜條件的優化

對3種目標化合物Tyr、Phe和Trp進行全波長掃描，最大吸收波長分別為275， 210和278 nm，故采用278 nm對Tyr和Trp定量分析，采用210 nm對Phe定量分析。通過比較流動相中緩沖溶液的不同濃度（5， 10， 20和50 mmol/L）以及不同pH 值（4.6， 5.6， 6.6和7.6），確定乙腈-10 mmol/L醋酸銨緩沖溶液（pH 5.6）作為流動相。梯度洗脫程序如2.2節所述，一個樣品的分析在40 min內可完成。

比較了Waters sunfire C18柱和Vertex TM AQ-C18柱對樣品中Tyr、Phe和Trp的分離效果，AQ-C18柱的流動相為上述優化條件，而Waters sunfire C18柱的流動相條件如下： 流動相A為甲醇，流動相B為10 mmol/L醋酸銨緩沖溶液； 梯度洗脫程序： 0～5 min，10% A； 5～20 min，10%～30% A； 20～35 min，30%～60% A； 35～36 min，60%～10% A； 36～40 min，10% A。圖1中a和b分別是采用Waters sunfire C18柱在210和278 nm檢測波長下分離得到的色譜圖； c和d分別是采用Vertex TM AQ-C18柱在210和278 nm檢測波長下分離得到的色譜圖。由圖1可見，使用Waters sunfire C18柱時，酪氨酸不能得到有效分離，而AQ-C18色譜柱能使樣品中3種氨基酸均得到有效分離。這是因為使用Waters sunfire C18柱時，流動相中水的比例一般不能超過90%，這不利于酪氨酸與胸腔積液中大量親水性物質的分離。而AQ-C18色譜柱是一種極性基團改性的C18柱，能與100%的水流動相兼容，對于親水性與極性化合物具有更強的保留能力和選擇性，因而使樣品中3種氨基酸既可有效分離，又各有合適的保留時間，且未受到其它色譜峰的干擾。因此，本實驗采用Vertex TM AQ-C18色譜柱分析胸腔積液中的3種氨基酸。

3.4 良惡性胸腔積液中Tyr、Phe和Trp含量差別

采用本方法對72例肺癌和肺部良性疾病患者胸腔積液進行了分析（圖2）。圖2中a～f分別為210和278 nm檢測波長下得到的3種氨基酸標準溶液、惡性及良性胸腔積液的色譜圖。圖中1、2和3所指色譜峰分別為酪氨酸，苯丙氨酸和色氨酸，其保留時間分別為6.24， 9.23和12.09 min，3種芳香族氨基酸均得到了有效分離。根據外標法計算得到沉淀蛋白后每個樣品中3種物質的含量（原實際樣品含量為該值的4倍，濃度分布范圍見表4），分別對肺癌組與肺部感染疾病組，肺癌組與結核性胸膜炎組，肺癌組與肺炎組以及結核性胸膜炎與肺炎組3種氨基酸含量采用獨立樣本t檢驗進行統計學分析，結果見表4。