高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜及特異性抑制劑探針方法研究異嗪皮啶的體外CYP450代謝產(chǎn)物及代謝亞型

摘 要：利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜及特異性抑制劑探針方法研究了異嗪皮啶在大鼠肝微粒體CYP450中的代謝產(chǎn)物及代謝亞型。結(jié)果表明，異嗪皮啶在大鼠肝微粒體的代謝時間為 2 h最佳，其主要代謝產(chǎn)物有5種。CYP 3A， CYP 2C， CYP 2E1等亞型為異嗪皮啶在大鼠肝微粒體內(nèi)的主要代謝酶。本方法為進(jìn)一步研究藥物-藥物相互作用提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：異嗪皮啶； 細(xì)胞色素P450； 代謝； 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜； 特異性抑制劑探針

1 引 言

異嗪皮啶是一種香豆素類化合物，是刺五加及草珊瑚、腫節(jié)鳳等中藥的主要活性成分之一，具有很好的抗癌、抗疲勞、抗應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)、利膽、抗菌、抗氧化等作用^[1～4]。臨床應(yīng)用于清熱涼血、活血化瘀、消腫止痛、抗菌消炎等諸多方面， 其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。目前以異嗪皮啶為指標(biāo)性成分對相關(guān)中藥及方劑進(jìn)行質(zhì)量控制的文獻(xiàn)較多，而針對異嗪皮啶的代謝研究的較少。

肝臟是藥物代謝的主要器官，細(xì)胞色素P450酶系（CYP450）是肝臟大部分藥物代謝最主要的Ⅰ相反應(yīng)酶，也是人體內(nèi)最重要的代謝酶。在肝微粒體中，CYP450藥物代謝多受CYP3A4，2C19，2C9，2D6和1A2的催化，也有少部分由2B6，2C8，1A1，2A6，2E1，2B1和2C10催化^[5]。藥物的肝臟內(nèi)代謝是藥物體內(nèi)過程的重要環(huán)節(jié)，通過藥物代謝的研究可以闡明藥物的代謝途徑及參與藥物生物轉(zhuǎn)化的酶，進(jìn)而對相關(guān)藥物在人體內(nèi)的代謝規(guī)律及特征進(jìn)行預(yù)測，確定可能影響藥物性質(zhì)的理化因素及可能發(fā)生的藥-藥相互作用，為新藥的研發(fā)和藥物臨床應(yīng)用的安全性提供依據(jù)。近年來，隨著CYP450在藥物代謝領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，越來越多的研究者將目光轉(zhuǎn)到了中藥成分的CYP450代謝方面^[6，7]。

本研究采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法對異嗪皮啶在大鼠肝微粒體中的主要代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究，根據(jù)串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定出5種代謝產(chǎn)物，并確定了其代謝途徑。此外，采用特異性抑制劑探針及LC-MS/MS方法，確定了異嗪皮啶主要的大鼠CYP450代謝亞型酶。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑及實驗動物

Finnigan LTQ XL離子阱質(zhì)譜儀，Accela U-HPLC超高效液相色譜系統(tǒng)（美國Thermo公司產(chǎn)品）；Diamonsil C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；Sanorius BSl10S分析天平（北京賽多利斯有限公司產(chǎn)品）； Optima L-100×P制備型超速離心機(jī)（貝克曼庫爾特實驗系統(tǒng)（蘇州）有限公司）；DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Eppendorf 5810R臺式高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）。

磺胺苯吡唑、α-萘黃酮、二乙基二硫代氨基甲酸銨、奧美拉唑、葡萄糖-6-磷酸、葡糖-6-磷酸脫氫酶、β-NADP（Sigma公司）；奎那定、酮康唑、8-甲氧基補(bǔ)骨脂素（日本TCI公司）。甲醇、乙腈（色譜純， 美國Fisher公司）；異嗪皮啶標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所）。水為二次去離子水。

清潔級雄性SD大鼠，體重（220±20）g，由吉林大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：（吉）2008-0005。

2.2 肝微粒體制備

2.3 微粒體孵育反應(yīng)體系及代謝反應(yīng)時間的確定

200 μL酶反應(yīng)體系^[9]，由100 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）， 0.5 mg/mL微粒體蛋白、NADPH生產(chǎn)系統(tǒng)（3.3 mmol/L葡萄糖-6-磷酸、0.4 U/mL葡糖-6-磷酸脫氫酶、1.3 mmol/L NADP+，3.3 mmol/L MgCl2）及終濃度200 μmol/L異嗪皮啶組成。37 ℃預(yù)孵2 min，加入NADP+起始反應(yīng)。反應(yīng)一定時間后加入200 μL冰乙腈終止反應(yīng)，然后將孵育混合物12000 g離心10 min。取上清液用于LC-MSn分析。

上述反應(yīng)體系分別反應(yīng)15，30，45，60，90，120和180 min后，處理樣品，比較反應(yīng)時間對異嗪皮啶代謝的影響。

2.4 確定代謝酶亞型的特異性抑制劑探針方法

利用CYP450酶亞型的特異性抑制劑，確定異嗪皮啶的CYP450代謝酶亞型^[10]。具體實驗條件如下：200 μL酶反應(yīng)體系，由100 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）、 0.5 g/L微粒體蛋白、NADPH生產(chǎn)系統(tǒng)（3.3 mmol/L葡萄糖-6-磷酸、0.4 U/mL葡糖-6-磷酸脫氫酶、1.3 mmol/L NADP+，3.3 mmol/L MgCl2）組成， 分別加入不同的特異性抑制劑：磺胺苯吡唑（CYP 2C）25 μmol/L；α-萘黃酮（CYP 1A2）25 μmol/L； 奎那定（CYP 2D）20 μmol/L；酮康唑（CYP 3A）10 μmol/L；二乙基二硫代氨基甲酸銨（CYP 2E1）50 μmol/L。37 ℃預(yù)孵5 min，然后加入異嗪皮啶，37 ℃孵育一定時間，樣品處理同2.3節(jié)。每組樣品平行做3份。

3 結(jié)果與討論

3.1 異嗪皮啶代謝反應(yīng)時間的確定

以產(chǎn)物M1為指標(biāo)，對不同反應(yīng)時間的異嗪皮啶反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測，以反應(yīng)時間為橫坐標(biāo)，不同時間的產(chǎn)物對原藥異嗪皮啶峰面積比之間的百分比為縱坐標(biāo)，結(jié)果見圖1。在2 h前，隨著時間的延長，反應(yīng)產(chǎn)物逐漸增多，而2 h后產(chǎn)物開始減少，說明代謝產(chǎn)物也可能開始發(fā)生降解。所以最佳反應(yīng)時間為2 h。

3.2 異嗪皮啶代謝產(chǎn)物及代謝途徑的確定

使用HPLC-MS分析了異嗪皮啶在CYP450反應(yīng)體系中的代謝產(chǎn)物，與空白滅活的CYP450反應(yīng)體系比較，異嗪皮啶在CYP450反應(yīng)體系中代謝的樣品在HPLC-DAD色譜圖（圖2a）中可以看到除原型藥異嗪皮啶色譜峰外，還有5個新增色譜峰。HPLC-MSn總離子流圖也發(fā)現(xiàn)共有5個新增質(zhì)譜峰（圖2b）。保留時間與HPLC相對應(yīng)。

4 結(jié) 論

用LC-MSn法鑒定出異嗪皮啶5種體外CYP450的代謝產(chǎn)物。即M1為異嗪皮啶開環(huán)形成的烯酸產(chǎn)物， M2為6-去甲基異嗪皮啶， M3為8-去甲基異嗪皮啶， M4為3-羥基異嗪皮啶， M5為4-羥基異嗪皮啶。

文獻(xiàn)[13]報道，異嗪皮啶在鼠體內(nèi)的主要代謝方式為原型入血，并以原型排出體外。I相代謝酶主要是增加水溶性，肝臟中I相酶系反應(yīng)是非合成反應(yīng)，如氧化反應(yīng)、還原反應(yīng)及水解反應(yīng)。它們能增加外源性物質(zhì)的極性。Ⅱ相的反應(yīng)是主要由專一性的轉(zhuǎn)化酶完成的結(jié)合作用。II相結(jié)合酶能使I相代謝酶的產(chǎn)物從機(jī)體內(nèi)排除^[14]，而I相酶中最主要的就是CYP450。研究表明，異嗪皮啶在肝臟中通過CYP450酶的作用，發(fā)生去甲基化、羥基化和開環(huán)羧酸化等作用，產(chǎn)生極性較原型藥物有很大提高的產(chǎn)物。這些產(chǎn)物及原藥繼而與Ⅱ相酶系結(jié)合，排出體外。此外，利用特異性抑制劑探針方法確定了異嗪皮啶的代謝酶亞型，為進(jìn)一步研究藥物相互作用提供了依據(jù)。