卡那霉素A酶聯適配體檢測方法研究

摘 要：通過EDC法偶聯辣根過氧化物酶（HRP）和卡那霉素A（Kanamycin，KaA）分子制備酶標記物，采用棋盤滴定法確定鏈霉親和素（Streptavidin，SA）的包被濃度為8 mg/L，通過單因素實驗優化了檢測條件，建立了卡那霉素A酶聯適配體檢測（Enzyme-linked aptamer assay，ELAA）方法。本方法半抑制濃度（IC50）為2.2 SymbolmA@ g/L，檢出限（LOD）為0.04 g/L，檢測范圍（IC20～IC80）為0.07～71.5 /L，與結構類似物無明顯交叉反應；對牛奶、豬肉、豬肝、雞肉、蜂蜜樣品加標回收率在78%～100%之間，平均相對標準偏差小于11.1%。本方法特異性強、靈敏度高，適用于食品中卡那霉素A的快速檢測。

關鍵詞：單鏈DNA（ssDNA）；適配體；卡那霉素A；酶聯適配體

1 引 言

卡那霉素（Kanamycin，KaA）是一種氨基糖苷類抗生素藥物，水溶性好，抗菌譜廣，是我國農業、畜牧業、水產業常用獸藥之一。但是，因嚴重的腎毒性、耳毒性、神經肌肉接頭的阻滯作用以及過敏反應^[1]，其在畜禽產品中的殘留危害日益引起人們關注。歐洲藥品評價局（The European Medicines Evaluation Agency， EMEA）規定肉中最大殘留限量（MRL）為100 μg/kg，牛奶中為150 μg/kg^[2]；日本規定動物組織中MRL為250 mg/kg^[3]。

目前，檢測的KaA方法主要有免疫測定法^[1]、高效液相色譜法（HPLC）^[4，5]等。免疫分析法靈敏、特異，簡單快速，但抗體制備復雜，研發周期太長^[6，7]；儀器方法準確可靠，但樣品前處理繁瑣，儀器昂貴。所以，研究者一直在尋找新的生物識別分子，以期建立更為簡便、靈敏的新方法。

適配體（Aptamer）是近年發展起來的一類單鏈寡核苷酸，可經體外合成，能高效、特異地結合各種目標分子，具有抗體無法比擬的優勢，無免疫原性和毒性，無需動物免疫，已成為近年生物分析的研究熱點之一^[8，9]。目前，適配體分析方法研究多集中于電化學傳感器、熒光法檢測^[10～12]，且在食品檢測中的報道尚不多^[13]。本研究通過鏈霉親和素-生物素放大策略，采用辣根過氧化物酶（HRP）標記卡那霉素，建立了一種高靈敏、高特異性的單鏈DNA（Single-stranded DNA， ssDNA）適配體檢測KaA的新方法，靈敏度遠高于已報道的酶聯免疫分析（ELISA）方法^[14，15]。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Multiskan MK3酶標儀、Wellwash MK2洗板機（美國Thermo公司）。SA（Promega公司）；HRP、KaA（Sigma Aldrich公司）； Na2HPO4、NaH2PO4、NaCl、檸檬酸、KCl、CaCl2、MgCl2等（分析純，廣州化學試劑有限公司）；生物素標記的KaA適配體（5′-biotin-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3′，上海生工生物工程有限公司合成）。實驗用水均為Milipore超純水。；牛奶、豬肉、豬肝、雞肉、蜂蜜樣品均購置于當地超市。

3 結果與討論

3.1 鏈霉親和素包被濃度優化

適配體通過5′端標記的生物素與微孔板上SA結合，SA包被量對檢測信號及靈敏度有很大影響^[11]。經優化當SA濃度為8 mg/L、適配體稀釋濃度為0.5 nmol/L時，其IC50值為8 μg/L， 分別約為其它組合的1/4倍和1/2倍（圖2）。因此，后續實驗選擇在SA濃度8 mg/L，適配體稀釋濃度0.5 nmol/L條件下進行。