化痰行瘀湯對肝纖維化大鼠組織病理學及羥脯氨酸含量的影響

陳國中 徐珊 張永生 朱飛葉

化痰行瘀湯對肝纖維化大鼠組織病理學及羥脯氨酸含量的影響

陳國中 徐珊 張永生 朱飛葉

目的 觀察化痰行瘀湯對肝纖維化的療效，并進一步探討其抗纖維化的作用機制。方法取清潔級健康成年Wistar大鼠60只，隨機抽取10只作為正常對照組，其余50只采用經典模型復制后隨機數字表法分為5組（造模過程中死亡11只），模型對照組（10只）、復方鱉甲軟肝片組（7只）、和化痰行瘀湯低（7只）、中（7只）、高（6只）劑量組，分別以相應藥物連續干預6周。采用樣本堿水解法檢測各組大鼠部分肝組織羥脯氨酸（Hyp）含量；并采用常規HE染色和苦味酸-天狼紅染色觀察肝纖維化程度。結果復方鱉甲軟肝片組、化痰行瘀湯各劑量組能明顯改善肝纖維化程度；化痰行瘀湯中劑量組的病理改變明顯，明顯降低肝組織Hyp含量（P＜0．05）。結論化痰行瘀湯能降低肝組織Hyp含量，明顯減輕病理改變，有效改善肝纖維化。

化痰行瘀湯 肝纖維化 大鼠 組織病理學 Hyp

【 Abstract】 ObjectiveTo assess the therapeutic effects of Huatan Xingyu (HTXY)decoction on experimental hepatic fibrosis in rats．MethodsSixty adult Wistar rats were included into 6 groups(n=10 in each):normal control group,model control group,Fufang Biejia Ruangan group,low-dose HTXY group,middle-dose HTXY group and high-dose HTXY group．The corresponding drugs were given for 6 weeks．After treatment,the hydroxyproline(Hyp)levels in hepatic tissues were detected by alkali hydrolysis method and the pathological changes of hepatic fibrosis were observed by HE staining and picric acid-sirius red staining．ResultsCompared to normal control and model control groups,the degree of hepatic fibrosis were significantly attenuated in Fufang biejia ruangan group and HTXY decoction groups(P＜0．05),and more markedly in middle-dose group．The Hyp levels in hepatic tissues were also significantly decreased in middle-dose HTXY group(P＜0．05)．ConclusionHTXY decoction can improve hepatic fibrosis and reduce hepatic tissue Hyp levels in rats with experimental hepatic fibrosis．

肝纖維化（hepatic-fibrosis，HF）是慢性肝病向肝硬化轉變的必經途徑，研究HF對預防肝硬化有深遠意義。本課題組挖掘國家名老中醫徐珊教授臨床數十年治療HF的經驗，結合有關HF文獻，提出化痰行瘀法抗HF，并采用其經驗方“化痰行瘀湯”進行抗HF療效實驗研究。本文主要闡述化痰行瘀湯對HF大鼠組織病理學及羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）的影響。

1 材料和方法

1.1 主要藥物及試劑的制備 取國家名老中醫徐珊臨床經驗方化痰行瘀湯方（桃仁10g、丹參10g、赤芍10g、郁金10g、浙貝15g、澤瀉30g）適量帖數，加水提取2次，第一次加3倍量水，浸泡0.5h，提取1.5h，第二次加1.5倍量水，提取1h，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至1.785g/ml的煎劑，臨用前配成0.4464g/ml，0.8925g/ml，1.785g/ml的灌胃液，備用。復方鱉甲軟肝片（內蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司產品，批號：20100411）臨用前研細用蒸餾水調成0.1mg/l0ml混懸液。40%CCl4橄欖油溶液：取40ml CCl4溶液，加入60ml橄欖油，混勻。5× TBE電泳緩沖液：稱取54g Tris，27.5g硼酸，加入20ml 0.5mol/L EDTA（pH 8.0）補充雙蒸水至1 000ml，此緩沖液稀釋10倍后即為0.5×TBE。

1.2 方法

1.2.1 動物造模 取清潔級健康成年Wistar大鼠60只，雄性，體重（200±20）g，適應性喂養1周后，隨機抽取10只作為正常對照組，其余50只采用經典模型復制法[1]按3ml/kg體重每周2次（首次加倍）皮下注射以橄欖油配制的40%CCl4，連續6周。正常對照組每周2次以等容量的橄欖油皮下注射。造模期間對實驗動物的進食、飲水不予限制。

1.2.2 模型評價 第6周末，從造模動物中隨機處死2只大鼠作HF病理學檢查，鏡下見中等度HF形成（纖維隔形成并互相連接，深入小葉內，小葉結構保留或紊亂，但無肝硬化），即確定HF模型復制成功[2]。造模結束后大鼠死亡11只，剩余37只大鼠按隨機數字表法分為5組：模型對照組10只、復方鱉甲軟肝片組7只、化痰行瘀湯低劑量組7只、化痰行瘀湯中劑量組7只、化痰行瘀湯高劑量組6只。

1.3 藥物干預 于分組當天開始灌胃給藥，復方鱉甲軟肝片組以1g/（kg·d）灌胃，化痰行瘀湯低、中、高劑量組分別以50、100、200mg/kg每天灌胃，正常對照組和模型對照組用0.9%氯化鈉溶液灌胃，2ml/d，連續給藥6周。給藥期間正常進食及飲水。

1.4 標本的采集及制備 治療6周結束后，大鼠禁食不禁水24h，用10%水合氯醛溶液（按4ml/kg體重）腹腔注射麻醉后剖腹，腹主動脈取血，5ml/只，靜置2h以上，3 500r/min，離心15min，吸取上清液，移至EP管中，封口，置-80℃冰箱中保存待測。

1.5 觀察指標

1.5.1 常規病理學檢查 （1）常規蘇木素-伊紅染色（HE染色）；（2）天狼紅染色。膠原增生的判斷按實驗動物HF組織學Ⅳ級標準[3]（以下簡稱“Ⅳ級標準”）光鏡下觀察肝組織膠原纖維、網狀纖維分布。

1.5.2 肝臟組織中羥脯氨酸（Hyp）含量檢測 采用樣本堿水解法測定Hyp含量，操作步驟如下：（1）準確稱取肝組織放入試管中，準確加水解液1.0ml，混勻。加蓋后沸水浴水解20min（水解10min混勻一次，目的是使水解更充分）；（2）將各試管流水冷卻后各管加指示劑1滴，混勻；（3）各管準確加入調pH甲液1.0ml至溶液變紅，混勻；（4）各管逐滴小心加入調pH乙液，混勻，至顏色變成黃綠色，pH值在6.0左右；（5）加蒸餾水至 10ml，混勻；（6）取稀釋后的檢測液3ml加適量活性炭，混勻，3 500r/min，離心10min，取上清液1.0ml直接按表1方法檢測。

1.6 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件。組間計量資料比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗。

表1 Hyp含量測定操作表

2 結果

2.1 化痰行瘀湯對HF大鼠組織病理學的影響

2.1.1 肝組織HE染色光鏡觀察 HE染色光鏡下觀察（圖1）：正常對照組大鼠肝小葉結構正常，肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，肝竇與匯管區成纖維細胞少（圖1A）；模型組大鼠肝小葉結構紊亂，肝細胞空泡變性，部分匯管區和小葉內有碎屑壞死，少量炎性細胞浸潤，間質細胞大量彌漫增生，纖維組織增生明顯，部分出現纖維間隔互相包繞整個肝小葉，假小葉形成（圖1B）；復方鱉甲軟肝片組大鼠肝小葉結構保持相對完整，炎性細胞浸潤減少，肝細胞壞死和纖維組織增生明顯減輕（圖1C）；化痰行瘀湯低劑量組大鼠肝小葉結構明顯改善，肝細胞變性以脂肪變為主，少量炎性細胞浸潤，肝細胞壞死減輕，纖維組織增生減輕（圖1D）；化痰行瘀湯中劑量組大鼠肝小葉結構保持相對完整，肝細胞壞死和纖維組織增生明顯減輕（圖1E）；化痰行瘀湯高劑量組大鼠肝小葉結構保持相對完整，肝細胞空泡變性減少，炎性反應及壞死減輕，纖維組織增生不明顯，接近正常肝組織（圖1F）。

2.1.2 肝組織苦味酸-天狼紅染色光鏡觀察 苦味酸-天狼紅染色光鏡下觀察（圖2）：正常對照組大鼠肝小葉結構清晰，僅在中央靜脈及肝竇內有少量膠原纖維分布（圖2A）；模型組大鼠肝組織匯管區和小葉間可見大量粗大增生的膠原纖維，相鄰匯管區之間纖維間隔連接并包繞形成以大方形和小圓形為主的假小葉（圖2B）；復方鱉甲軟肝片組大鼠肝組織匯管區纖維組織延伸明顯，部分纖維互相連接包繞整個肝小葉（圖2C）；化痰行瘀湯低劑量組大鼠肝組織匯管區纖維組織延伸明顯，部分纖維間隔形成，包繞整個肝小葉（圖2D）；化痰行瘀湯中劑量組大鼠肝組織匯管區纖維延伸明顯，但未包繞整個肝小葉（圖2E）；化痰行瘀湯高劑量組大鼠肝組織可見少量膠原纖維自匯管區或中央靜脈向外延伸（圖2F）。2.1.3 各組肝組織膠原增生程度 見表2。

由表2可見，正常對照組未出現HF表現。各治療組與模型組比較HF程度差異明顯。化痰行瘀湯各劑量組與復方鱉甲軟肝片組比較HF程度相近。化痰行瘀湯各劑量組間HF程度相近。

圖1 化痰行瘀湯對HF大鼠肝臟組織病理變化的影響（A：正常對照組；B：模型組；C：復方鱉甲軟肝片組；D：化痰行瘀湯低劑量組；E：化痰行瘀湯中劑量組；F：化痰行瘀湯高劑量組；HE染色，×200）

表2 各組大鼠肝臟組織HF分級比較（例）

圖2 化痰行瘀湯對HF大鼠肝臟組織纖維化程度的影響（A：正常對照組；B：模型組；C：復方鱉甲軟肝片組；D：化痰行瘀湯低劑量組；E：化痰行瘀湯中劑量組；F：化痰行瘀湯高劑量組；天狼紅染色×200倍）

2.2 化痰行瘀湯對HF大鼠肝臟組織Hyp的影響 見表3。

由表3和圖1可見，模型組Hyp較正常對照組顯著升高（P＜0.05）。各治療組Hyp都有不同程度的下降，化痰行瘀湯中劑量組下降最為明顯（P＜0.05）。化痰行瘀湯各劑量組與復方鱉甲軟肝片組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。化痰行瘀湯各劑量組間比較，Hyp差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 化痰行瘀湯對HF大鼠Hyp含量影響比較

3 討論

HF是指肝組織內細胞外基質（extracellu-larmatrix， ECM）成分過度增生與異常沉積，導致肝臟結構或功能異常的病理變化，是各種慢性肝病共有的病理特征，是發展到肝硬化的必經階段。而以肝星狀細胞（hepatic satellitecel，HSC）為中心環節，由枯否細胞、自然殺傷（naturalkiller，NK）細胞以及其他各種細胞和細胞間相互作用的信號因子共同構成，以綜合調控的方式影響HF的進程[4-5]。HSC在HF的形成過程中發揮關鍵性作用[6-8]。慢性肝損傷通過某些途徑激活靜止態HSC，活化的HSC產生大量ECM，ECM在Diss間隙內過度沉積，最終導致HF產生[9-10]。HSC與肝NK細胞、枯否細胞、肝細胞以及聚集于肝臟的其他炎癥細胞以相應的信號分子為介質，發生復雜交叉感應，打破細胞外基質的生成與降解平衡，觸發HF。大量的研究結果證實：HSC激活并轉化為肌成纖維樣細胞（MFBs）和成纖維細胞（FC）及大量合成、分泌ECM是HF發生發展的核心環節和共同通路[9]。調節HSC活化和ECM代謝是抗HF的關鍵。

化痰行瘀湯是國家名老中醫徐珊教授多年臨床治療HF行之有效的經驗方，課題組研究認為HF中醫病機是酒食、情志、濕熱疫毒、蠱毒等多病因侵犯肝臟，肝的疏泄失職，藏血失調，氣滯血瘀，肝脾不和，脾失健運，濕停痰聚，瘀責之肝，痰責之脾，瘀痰互結，故用化痰行瘀法來改善肝組織病理學，達到抗HF效果。

3.1 化痰行瘀湯對HF大鼠組織病理學的影響 HF是肝臟對各種原因所致肝損傷的創傷愈合反應，以肝內ECM過度沉積為特征。膠原纖維為ECM的主要成分之一，觀察膠原纖維沉積程度是研究HF的主要方法之一。本實驗中通過HE、苦味酸-天狼紅染色，觀察了化痰行瘀湯對HF大鼠肝組織病理學的影響。光學顯微鏡下觀察顯示：模型組肝臟組織脂肪變性、炎性細胞浸潤、膠原纖維沉積、肝小葉破壞、假小葉形成，均提示本次實驗模型復制成功。化痰行瘀湯各劑量組明顯改善HF程度，尤其是高劑量組鏡下顯示肝小葉結構保持相對完整，僅少量炎性細胞浸潤及膠原纖維沉積，提示其具有抗HF作用。HF的病理表現與中醫癥瘕積聚關系密切，可以作為癥瘕積聚的微觀表現，化痰行瘀湯明顯改善了HF程度，這可能與祛濕化痰、活血祛瘀藥物軟堅散結的作用有關，減少膠原纖維的沉積，從而起到了抗HF的作用。

3.2 化痰行瘀湯對HF大鼠肝臟組織Hyp的影響 Hyp在膠原組織中含量豐富[9]，系膠原肽鏈合成后，在脯氨酸羥化酶作用下，將肽鏈上的脯氨酸羥化形成，同時已形成的膠原又在膠原酶作用下分解，釋放Hyp，而膠原降解后，Hyp不再重復利用，從而使血中Hyp含量增加。肝組織Hyp代表了肝實質內的膠原纖維的增生，較血清Hyp更可以直接反映HF的程度和演變過程。本實驗中不同劑量化痰行瘀湯治療后，肝臟組織Hyp含量都有不同程度下降，表明本方能改善肝臟HF程度。

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（本文編輯：田云鵬）

《浙江醫學》對計量單位的要求

本刊執行GB 3100～3102-1993《量和單位》中有關量、單位和符號的規定及其書寫規則，具體執行可參照中華醫學會雜志社編寫的《法定計量單位在醫學上的應用》。注意單位名稱與單位符號不可混用。組合單位符號中表示相除的斜線多于1條時應采用負數冪的形式表示，組合單位中斜線和負數冪亦不可混用，如ng/kg/min應采用ng·kg-1·min-1的形式，不宜采用ng/kg-1·min-1的形式。在敘述中應先列出法定計量單位數值，括號內寫舊制單位數值；如果同一計量單位反復出現，可在首次出現時注出法定與舊制單位換算系數，然后只列法定計量單位數值。量的符號一律用斜體字，如吸光度（舊稱光密度）的符號“”。血壓仍以mmHg表示。

本刊編輯部

Efficacy of Huatan Xingyu Decoction in treatment of hepatic fibrosis in rats

Hua tan xing yu decoction Hepatic fibrosis Rats Histopathology Hydroxyproline

2012-11-21）

310012 杭州，浙江省立同德醫院中醫內科（陳國中）；浙江中醫藥大學基礎醫學院（徐珊、張永生、朱飛葉）