人脂肪干細胞復合珊瑚支架在三維培養下成骨活性的初步研究

朱金土 劉波 車菲 尚興紅 高壽松

●論 著

人脂肪干細胞復合珊瑚支架在三維培養下成骨活性的初步研究

朱金土 劉波 車菲 尚興紅 高壽松

目的 探討人脂肪干細胞（ADSCs）作為種子細胞復合珊瑚支架材料在體外三維培養下的成骨活性。 方法 取行脂肪抽吸術患者的脂肪組織，I型膠原酶消化進行培養，貼壁細胞傳代，取第2代細胞進行誘導，培養基中添加成骨誘導劑地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸和維生素D3。成骨誘導后復合珊瑚繼續培養，以未誘導的ADSCs復合物為對照，進行生長曲線、DIO染色后的共聚焦熒光顯微鏡、堿性磷酸酶（AKP）和骨鈣蛋白（OCN）生物化學定量檢測。 結果 7～8d后ADSCs在材料上生長進入平臺期，誘導ADSCs復合珊瑚7d后生長良好。誘導ADSCs AKP表達隨著時間的推移不斷增強，而且在檢測的各個時間點，誘導ADSCs AKP表達水平均明顯高于未誘導ADSCs（均P＜0.05）。誘導ADSCs在珊瑚支架上第7天后檢測到OCN表達，并一直增高，且從第7天開始OCN表達均明顯高于未誘導ADSCs（均P＜0.05）。 結論 脂肪干細胞復合珊瑚支架在三維培養下能夠向成骨細胞表型分化。

脂肪干細胞 珊瑚 堿性磷酸酶 骨鈣蛋白

已有實驗證實，從人脂肪組織抽吸物中可以獲取脂肪干細胞（adipose derived stromal cells，ADSCs），在成骨培養液誘導培養下能夠向成骨細胞分化[1]。組織工程核心是形成細胞-支架材料復合物來修復缺損，選用何種支架材料能夠使ADSCs在與生物支架材料共培養過程中繼續保持細胞的良好生長和成骨活性，仍是需要解決的重要問題。體內實驗研究提示，干細胞支架材料復合物有成骨活性[2-4]，但關于人ADSCs在支架材料上三維培養情況下的生長和成骨活性情況研究較少。本研究采用人ADSCs復合珊瑚支架材料進行三維培養，并測定其成骨活性，以期為骨組織工程研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 脂肪抽吸物均來自浙江省中醫院整形外科門診行脂肪抽吸術的患者；珊瑚由廣州海洋研究所提供；Ⅰ型膠原酶購自美國Worthington公司；AKP定量檢測試劑盒購自Sigma公司，OCN定量檢測試劑盒購自Biomedical technologies公司。DMEM培養液購自美國GIBCO公司、10%的FBS購自美國HYCLONE公司；胰蛋白酶、EDTA購自華美生物工程公司；地塞米松、β-磷酸甘油鈉和2-磷酸抗壞血酸購自Sigma公司，恒溫CO2培養箱購自美國Forma Scientific公司；倒置相差顯微鏡購自日本Nikon公司；SN 695B智能放免測量儀上海原子核研究所儀器一廠；U-640紫外分光光度計購自美國Beckman Coulter公司；酶聯免疫檢測儀Dialab公司。超聲勻漿機購自Sonics&Materials公司。

1．2 脂肪干細胞培養與傳代 無菌條件下將脂肪抽吸物用PBS反復沖洗，爾后移入離心管，加入等體積的0.075%的Ⅰ型膠原酶消化，37°C、1h，加帶血清培養液終止消化，1 380r/min離心10min，棄上清液，用100目細胞濾器過濾，再次1 380r/min離心5min，棄上清液，加入含10%FBS DMEM低糖培養液混勻細胞，以2×104/ cm2接種于100mm培養皿中培養。24h后，可見梭型細胞貼壁，每3d更換培養液1次，待細胞融合至約80%時進行傳代，傳代密度為1×104/cm2。擴增到第2代后，換成骨誘導液（0.01μmol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50μmol/L抗壞血酸和10μmol/L維生素D3）。

1.3 ADSCs在珊瑚支架上的生長曲線測定 將第2代的誘導和無誘導細胞各以5×106/ml的細胞懸液接種密度接種于3mm×3mm×3mm大小的珊瑚材料上，置入96孔板中，加入各自培養液，次日起每天隨機選擇4孔誘導和無誘導細胞-材料復合物，以4孔單純珊瑚作為陰性對照，每孔加入MTT溶液20μl，37℃孵育4h后終止培養，小心吸棄孔內培養上清液。每孔加入150μl二甲基亞砜，振蕩15min裂解細胞，使沉淀物充分溶解，隨后將溶液移至另一96孔板，在酶聯免疫檢測儀上測定每孔的光密度值（OD490），以時間為橫軸，OD490值為縱軸繪制細胞生長曲線。

1.4 DIO標記細胞及激光共聚焦熒光顯微鏡觀察細胞形態 另將第2代誘導ADSCs收集后制成細胞懸液，將DIO用無水乙醇配成2mg/ml的溶液，按1μl/10M的濃度標記細胞；標記前，將所需體積的DIO溶液用10% FBS DMEM稀釋250倍，加入ADSCs細胞懸液中，在37℃、5%CO2培養箱中孵育 20min，1 000r/min離心5min，棄上清液，加入PBS沖洗，1 000r/min離心5min，棄上清液，重復1次。標記細胞以5×106/ml的接種密度滴入3mm×3mm×3mm大小的珊瑚，確保材料被細胞懸液浸勻。接種4h后加入成骨誘導培養液，隔天換液1次，細胞材料復合物于接種后第1、3、5、7天行激光共聚焦熒光顯微鏡觀察，DIO的激發波長為484nm，發射波長為501nm。

1.5 ADSCs-珊瑚復合物體外培養后AKP活性定量檢測 將第2代的誘導和未誘導細胞各以5×106/ml密度接種于3mm×3mm×3mm大小的珊瑚材料上，置入96孔板中，加入各自培養液，隨后次日起在第1、3、7、14、21、28天每天分別各取6塊細胞-材料復合物，以6塊單純珊瑚作為陰性對照。操作步驟簡述如下：（1）stock substrate 40mg溶解于20ml去離子水中；（2）取36支15ml離心管分別標記實驗各組，另取1管作為空白組，各放入0.5ml Alkaline Buffer solution和0.5ml stock substrate solution，37℃水浴10min；（3）每塊標本置入15ml離心管中，PBS洗凈，將標本碾碎，加入3ml Tris（pH值7.4），超聲振蕩粉碎（90s、間隔9s、4℃）；（4）取0.1ml混合震蕩液加入已標記的離心管中，空白組加入0.1ml去離子水，繼續37℃水浴15min；（5）加入10ml 0.05mol/L NaOH終止，405nm紫外分光光度計測光密度值（OD值），以空白對照組進行調零；（6）0.0815OD值=1 Sigma U，1 Sigma U=1μmol ρ-nitrophenol/h。測定的AKP含量單位為nmol ρ-nitrophenol·min-1·塊-1。

1.6 ADSCs-珊瑚復合物體外培養后OCN活性定量檢測 將第2代的誘導和未誘導細胞各以5×106/ml密度接種于3mm×3mm×3mm大小的珊瑚材料上，置入96孔板中，加入各自培養液，隨后次日起在第1、3、7、14、21、28天各取6孔細胞-材料復合物200μl上清液，再取6孔單純珊瑚200μl上清液作為陰性對照，-20℃凍存留作檢測。每個時間點標本收集齊后按以下步驟進行標準濃度曲線和樣本中骨鈣素濃度測試：（1）各管中均加入100μl125I溶液；（2）實驗組管中加入100μlOCN抗血清；（3）振蕩混勻30s后37℃水浴2.5h；（4）各管中均加入100μl羊抗兔IgG和100μl PEG，室溫放置10min；（5）加入1ml預冷的緩沖液離心15min（4℃、4 200r/min）；（6）吸棄上清液，計數儀計數1min，再根據標準曲線得出骨鈣素的相應濃度。測定的OCN含量單位為ng/塊。1.7 統計學處理 采用SAS Ver.6.12統計軟件，所得數據均以表示，組間比較采用方差分析。

2 結果

2.1 ADSCs-珊瑚復合物體外培養的生長曲線 見圖1。

圖1 ADSCs在珊瑚上的生長曲線

由圖1可見，誘導和未誘導人ADSCs在支架材料上的生長曲線基本相同，其中在接種到珊瑚后的第1、2天，吸光度值變化不明顯為細胞的潛伏適應期，從第3天開始細胞迅速增加，第7～8天達最高，第9天則呈下降趨勢。細胞在材料上培養的潛伏期約為24～36h，對數增殖期約為3～6d，接種后第7～8天左右進入平臺期。誘導和未誘導ADSCs在珊瑚上的生長情況在各個時間點皆無明顯差別。

2.2 DIO標記細胞及激光共聚焦熒光顯微鏡觀察情況 接種后第1天，細胞黏附與支架材料的實質部分或在孔的邊緣上單層排列，細胞呈均勻的綠色熒光（圖2a）；第3天進入對數生長期后，細胞數量明顯增多（圖2b），至第5天時細胞呈多層排列（圖2c）；第7天細胞覆蓋了大部分材料表面充分伸展，融合成片，熒光強度未見減弱，細胞和其分泌的細胞外基質充填于珊瑚的孔隙中，占據著大部分空間（圖2d）。

2.3 ADSCs-珊瑚復合物體外培養后AKP活性定量檢測結果 見表1。

圖2 激光共聚焦熒光顯微鏡下所見（a：第1天；b：第3天；c：第5天；d：第7天）

表1 ADSCs-珊瑚復合物體外培養后AKP活性定量檢測結果（nmol ρ-nitrophenol·min-1·塊-1）

由表1可見，誘導ADSCs AKP表達隨著時間的推移不斷增強，而且在檢測的各個時間點，誘導ADSCs AKP表達水平均明顯高于未誘導ADSCs（均P＜0.05）。

2.4 ADSCs-珊瑚復合物體外培養后OCN活性定量檢測結果 見表2。

表2 ADSCs-珊瑚復合物體外培養后OCN活性定量檢測結果（ng/塊）

由表2可見，誘導ADSCs在珊瑚支架上第7天后檢測到OCN表達，并一直增高，且從第7天開始OCN表達均明顯高于未誘導ADSCs（均P＜0.05）。

3 討論

脂肪干細胞是近年的研究熱點之一，體外實驗已表明，在平面培養狀態下，人脂肪干細胞能夠向成骨細胞分化[1]。但關于人脂肪干細胞復合材料三維培養狀態下的成骨狀況卻鮮有報道。珊瑚作為一種天然材料有著許多人工材料無可比擬的優點，天然珊瑚的孔徑和孔隙率分別為（150±50）μm和（57.60±1.50）%，孔與孔之間都有小孔天然連通形成網絡樣空間結構，類似于正常骨[5]。珊瑚具有良好的力學強度，且孔隙率高于30%，是組織工程化骨的良好生物材料[6-7]。

本研究結果顯示，成骨誘導的ADSCs在第3天進入對數生長期，細胞數量迅速增加，第7～8天進入平臺期。生長曲線測定表明，ADSCs在天然珊瑚支架上增殖狀況良好。為了進一步觀察三維培養下的細胞形態及細胞外基質的分泌情況，本實驗通過DIO（DIO是最常用的細胞膜熒光探針之一，呈現綠色熒光[8]）標記細胞，然后借助激光共聚焦熒光顯微鏡進行觀察，發現成骨誘導的ADSCs第7天細胞覆蓋了大部分材料表面充分伸展，融合成片，細胞形態良好，與其分泌的細胞外基質充填于珊瑚的孔隙中，占據著大部分空間。

AKP是成骨細胞分化的標志，在體內鈣化過程中起關鍵作用，其活性高低可反映成骨細胞的成熟狀況，AKP活性越高，表明細胞向成骨細胞分化的程度越高[9]。本文結果顯示，誘導組不同時點AKP活性隨誘導時間延長而增強，與對照組比較差異有統計學意義。OCN是骨組織中成骨細胞合成的特異性蛋白，是骨代謝細胞分化成熟，處于功能狀態的標志，可作為成骨細胞活動的標志性產物[10-11]。本文結果顯示，在7d后的各個時間段誘導的ADSCs-材料組OCN表達均顯著高于對照組，說明在材料上三維生長的情況下，雖然誘導和未誘導ADSCs都有成骨分化，但誘導ADSCs的成骨活性明顯更強。由此可見，珊瑚材料作為三維支架是適合人ADSCs向成骨誘導分化的，天然珊瑚是ADSCs生長和成骨轉化的良好生物支架材料，有可能成為ADSCs的生物支架用于組織工程化骨的構建。

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Osteogenesis ability of human adipose stem cells on coral scaffolds in vitro

ZHU Jintu，LIU Bo，CHE Fei，et al.
Department of Plastic and Reconstructive Surgery，Zhejiang Traditional Chinese Medicine Hospital，Hangzhou 310006,China

Objective To investigate the osteogenic ability of human adipose stem cells(ADSCs)in coral scaffolds in vitros. Methods ADSCs were isolated from liposuction aspirates,then digested by type I collagenase;the passage 2 cells were cultured in conditioned medium containing dexamethasone,β-glycerophosphate,ascorbate-2-phosphate and VD3.The induced cells were co-cultured with coral scaffold and non-induced ADSCs-coral construct served as control.The constructs were examined with growth curve,confocal microscopy and quantitative histochemistry. Results The growth curve demonstrated that the proliferation of ADSCs on coral scaffolds reached plateau after 7-8 d of co-culture.Confocal microscopy and quantitative histochemistry showed that ADSCs grew well and began to express osteocalcin on the coral scaffolds after 7d of culture. Quantitative histochemistry demonstrated that the expressions of alkaline phosphatase(AKP)and osteocalcin(OCN)in induced ADSCs-scaffold were higher than those in non-induced ADSCs-scaffold(P＜0.05). Conclusion The coral scaffold is a good biomaterial for ADSCs growth and being induced to osteoblasts.

Adipose derived stromal cells CoralAlkaline phosphatase Osteocalcin

2012-12-28）

（本文編輯：歐陽卿）

浙江省自然科學基金資助項目（Y2080180）

310006 杭州，浙江省中醫院整形外科