術前動脈化療栓塞對膀胱癌細胞增殖和凋亡、血管生成的影響

王榮江 石麒麟 趙紅星 邵四海 鄭銀元 陳煜

術前動脈化療栓塞對膀胱癌細胞增殖和凋亡、血管生成的影響

王榮江 石麒麟 趙紅星 邵四海 鄭銀元 陳煜

目的 探討術前動脈化療栓塞對膀胱癌細胞增殖和凋亡及腫瘤血管生成相互關系的影響及臨床意義。 方法 分別選取術前行動脈化療栓塞及同期單純手術治療的膀胱癌患者50例（觀察組）、30例（對照組），采用EliVision二步法檢測Ki-67的表達情況，細胞凋亡檢測應用DNA末端標記法（Tunel法），計算凋亡指數（AI）、增殖指數（LI）和微血管密度計數（MVD）。比較兩組患者的3年生存率和復發率。分析觀察組患者化療栓塞前后AI、LI、MVD的變化及其與患者預后的關系。結果 兩組患者3年生存率的差異無統計學意義（P＞0.05），觀察組3年復發率顯著低于對照組（P＜0.01）。觀察組患者栓塞后MVD及LI顯著下降、AI顯著升高（均P＜0.01），其中高分級、浸潤性及初發患者栓塞后MVD及LI明顯下降、AI顯著升高，復發患者僅MVD明顯下降，差異均有統計學意義（P＜0.05或0.01）。AI與LI、MVD呈負相關（P＜0.01），LI與MVD呈正相關（P＜0.01）。觀察組中復發與未復發者栓塞前后MVD的差異均有統計學意義（均P＜0.05），未復發者栓塞后LI顯著下降、AI顯著升高（P＜0.01）；生存者栓塞后MVD、LI明顯下降、AI顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05或0.01）。 結論 細胞的增殖和凋亡狀況、微血管密度可作為膀胱癌的預后評估指標。術前動脈化療栓塞可以明顯降低膀胱癌組織的LI和MVD，增高AI，調節膀胱癌的分化程度，降低復發率。

化療栓塞 膀胱癌 凋亡指數 增殖指數 微血管密度

膀胱癌生物學行為復雜多變，突出表現為易復發、多發、浸潤和轉移。已有的研究表明，細胞增殖失控和細胞凋亡障礙是膀胱癌發生、發展的重要原因。腫瘤發展過程中血管生成可以影響腫瘤細胞的凋亡和增殖狀態。本研究通過觀察術前動脈化療栓塞的膀胱癌患者膀胱癌組織中增殖指數（LI）、凋亡指數（AI）和微血管密度（MVD）的表達，旨在探討動脈化療栓塞對膀胱癌細胞增殖和凋亡及腫瘤血管生成的影響及臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2004-01—2010-06我院收治的膀胱癌患者50例（觀察組），男35例，女15例，年齡38～78（60.98±9.05）歲；術前均行動脈栓塞化療。根據國際抗癌聯盟腫瘤浸潤深度分期：非浸潤性癌16例，浸潤性癌34例。根據WHO 2004年膀胱尿路上皮癌惡性程度病理分級：低分級尿路上皮癌13例，高分級尿路上皮癌37例。淋巴轉移5例，盆壁浸潤3例，腹腔轉移2例，肺轉移2例；單發29例，多發21例，因復發入院者14例。術后經病理證實單純尿路上皮細胞癌44例，尿路上皮細胞癌合并腺癌3例，合并鱗癌3例。同期另擇單純手術治療的膀胱癌患者30例作為對照組，男20例，女10例，年齡29～80（59.62±10.13）歲。非浸潤性癌8例，浸潤性癌22例。低分級尿路上皮癌7例，高分級尿路上皮癌23例。淋巴轉移2例，盆壁浸潤1例，腹腔轉移0例，肺轉移2例；單發16例，多發14例，因復發入院者7例。術后經病理證實單純尿路上皮細胞癌27例，尿路上皮細胞癌合并腺癌2例，合并鱗癌1例。兩組患者性別、年齡、浸潤深度、病理分級及轉移、合并等情況的差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 動脈化療栓塞 采用Seldinger技術，局麻下經皮穿刺，用5～6Fcobra導管選擇一側股動脈進路至髂內動脈，先行盆腔動脈造影明確腫瘤部位及膀胱動脈供血情況，再分別超選擇性至膀胱動脈至腫瘤區域主要供血動脈分支，了解腫瘤血管的形態和走向，結合術前膀胱鏡示腫瘤位置，放置導管位置一般超選至膀胱動脈口，給予絲裂霉素20mg或羥喜樹堿10mg聯合順鉑60mg藥物灌注+明膠海綿顆粒栓塞治療1次。化療栓塞后7d行經尿道膀胱腫瘤電切或膀胱部分切除術。

1.2.2 標本制備及檢測 觀察組患者化療栓塞前膀胱鏡檢查所取腫瘤標本及化療栓塞后手術標本，常規經10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋。Ki-67檢測：選取代表性蠟塊連續4μm切片，采用EliVision二步法行免疫組化染色，使用鼠抗人Ki-67單克隆抗體、鼠抗人CD34單克隆抗體，參照試劑盒說明書操作；EliVision試劑盒及相應抗體均購自福州邁新生物技術有限公司，以PBS代替一抗作陰性對照，以已知陽性切片作為陽性對照。細胞凋亡檢測應用DNA末端標記法（Tunel法）。

1.3 判定標準 LI判定標準：以腫瘤細胞膜或細胞核有棕色顆粒著色為陽性標記,計數隨意5個400倍視野的癌巢區陽性細胞數，LI=（Ki-67陽性細胞數/觀察細胞數）×100%。MVD判定標準：腫瘤組織及其鄰近間質內，胞膜或胞質內出現棕黃色顆粒的內皮細胞或內皮細胞簇即被認為是單個微血管。MVD參照Weidner等[1]報道的方法，先在40倍光學顯微鏡下掃描，選取腫瘤組織內微血管高度密集區，即“熱點”，然后在400倍視野下計數腫瘤內的微血管的數目，記錄3個視野中的微血管數目并取其平均數。AI判定標準：細胞核中出現棕褐色顆粒者為陽性細胞，即凋亡細胞。隨機選擇5個400倍視野并計數1 000個腫瘤細胞，記錄凋亡細胞數，其中陽性細胞所占百分比即為AI，AI=（凋亡細胞數/1000）× 100%。

1.4 觀察指標 觀察化療栓塞前后腫瘤細胞增殖和凋亡、MVD表達情況及術后患者生存率和復發率，分析免疫組化結果與病理分級、分期及預后的相關性。

1.5 統計學處理 采用SPSS10.0統計軟件，計量資料均以表示，栓塞化療前后的比較采用t檢驗，組間率的比較采用χ2檢驗，相關性采用Pearson相關性分析。

2 結果

2.1 兩組患者3年生存率及復發率的比較 對照組3年生存率為83.3%（25/30），觀察組為88.0%（44/50），差異無統計學意義（P＞0.05）。對照組1、2、3年復發率分別為10.0%（3/30）、13.3%（4/30）、30%（9/30），觀察組分別為8.0%（4/50）、4.0%（2/50）、6.0%（3/50），觀察組3年復發率顯著低于對照組（P＜0.01）。

2.2 觀察組患者化療栓塞前后膀胱癌組織的比較 見圖1～6。

圖 1 栓塞前AI較低（Tunel法，×400）

圖2 栓塞前Ki-67表達較強（EliVision二步法，×400）

圖3 栓塞前MVD較高（EliV-ision二步法，×400）

圖 4 栓塞后 AI升高（Tunel法，×400）

圖5 栓塞后Ki-67表達減弱（EliVision二步法，×400）

由圖1～6可見，化療栓塞后MVD、Ki-67表達強度下降，AI明顯升高。

圖6 栓塞后MVD降低（EliVision二步法，×400）

2.3 觀察組患者化療栓塞前后膀胱癌組織MVD、AI、LI值的比較 見表1。

表1 觀察組患者化療栓塞前后膀胱癌組織MVD、AI、LI值的比較

由表1可見，觀察組患者栓塞后MVD及LI值顯著下降、AI顯著升高，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。其中高分級、浸潤性及初發患者栓塞后MVD及LI值明顯下降、AI顯著升高，復發患者僅MVD值明顯下降，差異均有統計學意義（P＜0.05或0.01）。Pearson相關性分析顯示，AI與LI、MVD呈負相關（P＜0.01），LI與MVD呈正相關（P＜0.01）。

2.4 MVD、AI、LI值與栓塞后腫瘤復發和生存的關系

觀察組患者隨訪6～78個月，平均19.8個月。動脈化療栓塞前后MVD、AI、LI表達與患者預后和生存的關系見表2～3。

表2 MVD、AI、LI值與患者預后的關系

表3 MVD、AI、LI值與患者生存的關系

由表2～3可見，復發與未復發者栓塞前后MVD值 的差異均有統計學意義（均P＜0.05），復發者栓塞前后AI、LI值的差異均無統計學意義（均P＞0.05），而未復發者栓塞后LI值顯著下降、AI值顯著升高，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；死亡者栓塞前后3項指標的差異均無統計學意義（均P＞0.05），生存者栓塞后MVD、LI值明顯下降、AI值顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05或0.01）。

3 討論

細胞增殖和凋亡狀況是預測膀胱癌發展及預后的重要指標，研究腫瘤增殖和細胞凋亡是了解腫瘤和控制腫瘤的一條途徑。細胞增殖失調和細胞凋亡障礙是膀胱癌惡性增生發生、發展的重要原因[1-2]。

1971 年，Folkman等[3]提出了“腫瘤的生長與轉移依賴于腫瘤血管的形成”的概念。腫瘤的新生血管化程度與腫瘤惡性程度、侵襲性及其預后密切相關[4]。MVD是反映腫瘤微血管形成程度的標志，不僅可定量反映出膀胱腫瘤的血管生長情況，而且一定程度上可作為預測腫瘤浸潤、轉移、復發和判斷預后的一項指標。腫瘤發展過程中微環境的改變可以影響到腫瘤細胞的凋亡和增殖狀態[5]，而血管生成正是微環境改變的重要表現形式之一。

膀胱癌細胞凋亡與腫瘤分級和分期呈負相關，AI是衡量組織中細胞凋亡發生程度的一項指標。細胞凋亡多者，說明腫瘤在各種因素的作用下，其生長繁殖受到限制，腫瘤的惡性程度低，因此預后較好。相反，細胞凋亡少則說明腫瘤受限制的程度差，腫瘤惡性程度高，患者預后較差[6]。腫瘤LI的檢測對于判斷腫瘤的惡性程度、評估預后及選擇適當的治療措施意義重大。Ki-67是與增殖細胞相關的核抗原，為細胞增殖的一種標記，其表達水平不僅能客觀反映膀胱癌的增殖活性，并能估計腫瘤的浸潤、轉移潛能，Ki-67的陽性表達與腫瘤惡性程度正相關，表達越高，腫瘤增生活躍，復發的可能性越高。因此檢測Ki-67在腫瘤中的表達強度，可以評估腫瘤細胞的生物活性并提供腫瘤演變的信息[7-8]。

本研究發現，膀胱腫瘤中微血管的形成與腫瘤細胞的增殖活性及其AI明顯相關，AI與LI、MVD呈負相關，LI與MVD呈正相關。本組表淺性腫瘤的AI顯著高于浸潤性腫瘤，而浸潤性腫瘤的MVD顯著高于表淺性腫瘤，表淺腫瘤處于血管形成前期時以細胞凋亡為主，以抵消細胞的過度增生，使病變保持相對的靜止狀態。一旦進入血管期，新生血管形成，血管內皮細胞及宿主的良性細胞產生的各種生長因子通過新生血管源源不斷運至腫瘤細胞，同時改善了腫瘤細胞的缺氧狀態，致使細胞凋亡減少、細胞增殖，這也是膀胱癌發生、發展的原因之一[9]。

膀胱癌術前超選擇性腫瘤動脈化療栓塞，切斷了腫瘤的血供，造成癌細胞缺血缺氧，減低腫瘤細胞活力，加快其壞死[10]，顯著提高腫瘤局部及盆腔區域的初始抗癌藥物濃度；化療藥物發揮細胞毒作用都與誘導細胞凋亡和抵制細胞增殖有關。同時，抑制腫瘤新生血管生成及增殖細胞核抗原下降，誘導促凋亡基因表達，使膀胱癌細胞發生凋亡，增殖抑制；有遏制癌細胞進一步分化、浸潤和轉移作用[11-12]。本研究結果顯示，動脈化療栓塞后腫瘤縮小，表面均有組織的不同程度壞死，術野清晰，術中基本無出血，3年復發率明顯降低。

化療栓塞后MVD、LI明顯下降，AI升高，前后差異有統計學意義。化療栓塞后MVD、LI隨著腫瘤的病理分級、臨床分期的升高而降低，AI隨著病理分級的增高而增高，化療栓塞前后低分級和非浸潤性膀胱癌組織中陽性表達水平比較，差異均無統計學意義；而高分級和浸潤性膀胱癌組織中陽性表達水平差異均有統計學意義。AI、LI在初發膀胱癌者栓塞前后有統計學意義，在復發膀胱癌中無統計學意義，MVD在初發和復發膀胱癌栓塞前后下降均有統計學意義。以上結論均說明動脈化療栓塞后腫瘤組織內的血管減少，腫瘤生長受限，甚至因缺血而使腫瘤壞死，還可通過誘導腫瘤細胞凋亡，抑制細胞增殖達到腫瘤消失或縮小的目的。MVD、AI、LI與栓塞后腫瘤復發率和患者生存率有明顯的相關性，MVD、LI與病死率和復發率呈正相關，AI則呈負相關。

綜上所述，術前動脈化療的抗腫瘤效應與誘導細胞凋亡和抑制細胞增殖密切相關，可以明顯地降低高分級和浸潤性膀胱癌組織的LI和MVD值，增高細胞凋亡率，但對低分級和非浸潤性無明顯影響，這能否作為術前動脈化療適應證之一尚有待進一步證實，但對于選擇適合術前動脈化療患者具有一定指導意義，同時術前動脈化療具有降低術后復發率的優點。

[1]郭曉華,米振國.凋亡抑制基因及PCNA在膀胱移行細胞癌中表達的意義[J].臨床醫藥實踐雜志,2006,15(3):172-175.

[2]McKnightJJ,GrayS B,O'KaneHF,et al.Apoptosis and chemotherapy for bladder cancer[J].J Urol,2005,173(3):683-690.

[3]Folkman J.Tumor angiogenesis:therapeutic implications[J].N Engl J Med,1971,285(21):1182-1186.

[4]Li C,Guo B,Bernabeu C,et al.Angiogenesis in breast cancer:the role of transforming growth factor beta and CD105[J].Microsc Res Tech,2001,52(4):437-449.

[5] Elfiky A A,Rosenberg J E.Targeting angiogenesis in bladder cancer[J].Curr Oncol Rep,2009,11(3):244-249.

[6]楊承綱,張麗娟,陳蕓.細胞凋亡在膀胱移行細胞癌中的預后價值[J].實用醫技雜志,2006,13(19):3337-3338.

[7]Sanchez-Carbayo M,Socci N D,Lozano J J,et al.Gene discovery in bladder cancer progression using cDNA microarrays[J].Am J Pathol,2003,163(2):505-516.

[8]Lopez-Beltran A,Luque R J,Alvarez-Kindelan J,et al.Prognostic factors in stage T1 grade 3 bladder cancer survival:the role of G1-S modulators(p53,p21Waf1,p27kip1,Cyclin D1,and Cyclin D3)and proliferation index(ki67-MIB1)[J].Eur Urol,2004,45(5): 606-612.

[9]劉賢奎,孔垂澤,王平,等.膀胱癌腫瘤血管生成與腫瘤細胞凋亡和增殖的關系[J].中國醫科大學學報,2004,33(5):438-439.

[10]王榮江,邵四海,趙紅星,等.化療栓塞對膀胱腫瘤新生血管生成及血管內皮細胞生長因子表達的影響[J].中華泌尿外科雜志,2008,29 (7):470-474.

[11]Koumenis C,Alarcon R,Hammond E,et al.Regulation of P53 by hypoxia:dissociation of transcriotional repression and apoptosis from P53-dependent transactivation[J].Mol cell boil,2001,21 (4):1297-1310.

[12]Rudinger H A,Clacient P A.Tumor necrosis factor alpha,but not FAS,mediates hepatocellular apoptosis in the murine ischemic liver[J].Gastroeterology,2002,122(1):202-210.

Cell proliferation,apoptosis and neovascularization of bladder cancer after arterial chemoembolization

Chemoembolization Bladder cancer Apoptosis index Proliferation index Microvessel density

2012-05-07）

（本文編輯：歐陽卿）

313000 湖州師范學院附屬第一醫院、湖州市第一人民醫院泌尿外科（王榮江、邵四海、陳煜），病理科（石麒麟），放射介入科（趙紅星、鄭銀元）

【 Abstract】Objective To investigate the cell proliferation,apoptosis and tumor angiogenesis of bladder cancer after transcatherter arterial chemoembolization(TACE). Methods The apoptosis index(AI)，proliferation index(LI)and microvessel density(MVD)of cancer tissue were examined by immunohistochemistry in 50 bladder cancer patients before and after chemoembolization (TACE group)and in 30 patients with surgical treatment(control group).The 3-y survival rates and recurrence rates were compared between two groups.The correlation of cancer cell proliferation,apoptosis and MVD before and after chemoembolization with postoperative survival and the recurrence was analyzed. Results There was no significant difference in 3-y survival rate between two groups(P＞0.05).The 3-year recurrence rate in TACE group was significantly lower than that in control group(P＜0.01).AI was increased significantly after chemoembolization,while MVD and LI were decreased significantly(P＜0.01), especially for the high grade,invasive or incipient patients.But the relapsing patients had only decline of MVD.AI was negatively correlated with MVD and LI(P＜0.01),while LI was positively correlated with MVD(P＜0.01).There was significant difference in MVD of cancer tissue between relapsed group and non-relapsed group both before and after chemoembolization.LI declined significantly,while AI increased significantly in non-relapsed group after chemoembolization(P＜0.01). Conclusion The cancer cell proliferation,apoptosis and microvessel density may be used as indicators in assessing prognosis for bladder cancer.Preoperative chemoembolization can decrease LI and MVD and increase apoptosis rate in bladder cancer tissue,resulting in the decrease of recurrence rate.