GAD基因修飾神經干細胞在創傷性顱腦損傷大鼠中的作用

艾玲玲 譚曉東 楊露露

GAD基因修飾神經干細胞在創傷性顱腦損傷大鼠中的作用

艾玲玲 譚曉東 楊露露

目的 探討移植谷氨酸脫羧酶（GAD）基因修飾的神經干細胞（Neural Stem Cells，NSCs）在創傷性顱腦損傷（TBI）大鼠中的作用。 方法 將40只雄性SD大鼠隨機分成4組，每組10只。利用電穿孔轉染大鼠NSCs，通過腦立體定向儀分別將GAD轉基因NSCs（GAD+NSCs組）、NSCs（NSCs組）、磷酸鹽緩沖液（PBS，PBS組）移植到TBI大鼠局部損傷灶附近，通過TUNEL法檢測NSCs的凋亡情況，對照組大鼠不做處理，并進行神經損壞嚴重程度評分（neurological severity score，NSS）對移植后大鼠的神經系統行為和運動功能進行評估。結果 NSS結果顯示GAD+NSCs組和NSCs組在第10、20、30天神經功能評分均低于PBS組（P＜0.05）；GAD+NSCs組在第10和20天神經功能評分低于NSCs組（P＜0.05）；在轉基因NSCs移植7d后神經細胞凋亡數明顯最少。 結論 轉基因NSCs移植后合成GDA能夠促進TBI大鼠神經功能的恢復。

GDA 神經干細胞 創傷性顱腦損傷

創傷性顱腦損傷（traumatic brain injury,TBI）后，損傷中心區域的神經細胞由于暴力撞擊，部分細胞當即壞死，損傷區域周圍殘存的神經細胞因缺血、興奮性神經遞質釋放、炎癥反應等而發生凋亡[1]。因此，通過補償死亡的神經細胞和挽救瀕臨死亡的神經細胞來修復神經損傷是TBI的研究熱點。相關研究表明，將神經干細胞（neural stem cells,NSCs）植入神經系統疾病的動物模型中可促進實驗動物的神經功能部分恢復[2]。近年來研究發現顱腦損傷后伴有保護抑制性神經遞質伽馬氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）的釋放，從而可以保護大腦功能在原發性打擊后，突觸間隙及細胞外液谷氨酸濃度急速升高而造成的免遭繼發性顱腦損傷（secondary brain injury，SBI）的損害[3]。本研究首次通過觀察GAD基因修飾的NSCs移植到TBI模型的受損腦皮層后，大鼠神經功能及細胞凋亡的改變，為TBI的治療尋求新思路。

1 材料和方法

1.1 動物與分組 選取健康雄性SD大鼠40只，體重250g左右，由浙江大學醫學院動物實驗中心提供。隨機分成對照組、磷酸鹽緩沖液（PBS）組、NSCs組、GAD+ NSCs組，每組各10只。實驗過程中對動物處置符合動物倫理學標準。

1.2 菌株、質粒及主要試劑 pcDNA3.1（+）-GAD真核表達載體由杭州百替生物技術有限公司提供，E.coli DH5α、限制性內切酶HindⅢ、XhoⅠ以及DMEM培養基購自Gibco公司；T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司；核酸提取試劑盒，膠回收純化試劑盒，反轉錄試劑盒，Real-Time PCR試劑盒等購自TIANGEN公司；胎牛血清購自Hyclone公司。

1.3 方法

1.3.1 NSCs培養、電穿孔轉染及GAD表達鑒定 常規分離初生SD大鼠大腦皮層組織，根據田志紅等[4]的方法培養和鑒定NSCs。原代培養14d的NSCs，500g/min離心5min。用適量電穿孔緩沖液重懸細胞至5×108/ml，取500μl細胞懸液，加入20μg重組子質粒DNA，混勻后靜置4min加到4mm電轉化池中，在電壓350V，電容100μF的條件下，電擊1次，靜置3min后將細胞轉移至12孔板中，繼續培養48h后，加入含G418的培養基篩選出穩定轉染的細胞，Real-Time PCR檢測電轉前后GAD表達情況。提取轉染前后細胞的總RNA，按試劑盒說明檢測GAD基因的mRNA表達。設計上游引物：5′-AGATCTTACGAGCGTTGAAGGCCA-3′，下游引物：5′-TCCGAAGACCCAGATTTCCTTGCT-3′。

1.3.2 大鼠TBI模型建立 PBS組、NSCs組、GAD+NSCs組采用美國Am Scien Instruments公司FP302型顱腦損傷液壓裝置，參照Sun等[5]的顱腦液壓損傷模型制備方法，大鼠用10%水合氯醛，按3.5g/kg的劑量對大鼠進行腹腔內注射麻醉后，將頭部固定于立體定位儀，顱頂部剃毛、消毒，切開頭皮至骨膜。于前囪后3.5mm、中線偏右2.0mm顱骨處鉆孔，骨窗直徑5.0mm，注意保持硬膜完整。用液壓腦損傷撞擊儀打擊1次，打擊強度（2.41± 0.05）ATM，模擬中度顱腦損傷。對照組不做處理。

1.3.3 細胞移植 將PBS組、NSCs組、GAD+NSCs組大鼠通過腦立體定向儀分別于骨窗邊緣前、后1/3兩點移植，每一移植點分別在皮下4mm及2mm深度進行[6]。PBS組僅移植10μl PBS；NSCs組移植10μl含有約5×108個NSCs的PBS；GAD+NSCs組移植10μl含有約5×108個轉基因NSCs的PBS，每次移植后留針10min，緩慢退針5min，縫合頭皮。

1.3.4 細胞凋亡的觀察 分別于移植后1、10、20、30d時間點處死4組大鼠，取移植點附近2mm厚的腦組織，放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）中固定24h后，進行石蠟包埋，將包埋好的腦組織蠟塊進行連續切片，60℃烤箱內烤片1h進行固定。石蠟切片用TUNEL法檢測顱腦損傷部位附近神經細胞的凋亡情況[7]。400倍光鏡下取每個視野的凋亡陽性細胞數，細胞核藍紫色為陽性，每張切片隨機取6個視野，然后取平均值。

1.3.5 NSS神經功能評分[8]及旋轉爬桿實驗評分 分別于移植手術后1、10、20、30d對各組動物進行NSS評分，測試時進行3次，取其平均值。同時對照組大鼠進行評分。

1.3.6 統計學處理 采用SPSS13.0軟件進行分析，計量資料以表示，組間比較采用方差分析。

2 結果

2.1 NSCs的體外培養及GAD在轉基因細胞中的表達 原代培養第6天可見大小不等的懸浮生長的神經細胞球，機械吹打傳代后，單個NSCs又繼續形成神經細胞球（圖1）。Real-Time PCR結果顯示，GAD在轉染后的NSCs mRNA表達增強（圖2）。

圖1 神經干細胞原代培養6d形成的神經干細胞球（×200）

圖2 GAD的mRNA在轉基因NSCs中的相對表達水平

2.2 各組大鼠不同時間點凋亡陽性神經細胞數比較 見表1。

表1 各組大鼠不同時間點凋亡陽性神經細胞數比較

由表1可見，對照組各時點凋亡陽性細胞數均低于其他3組。3組TBI大鼠比較，PBS組凋亡陽性細胞數均高于其余兩組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；GAD+NSCs組凋亡陽性細胞數稍低于NSCs組，其中第10、20天差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠神經細胞凋亡情況（a：正常對照組；b：PBS組；c：NSCs組；d：GAD+NSCs組）

2.3 移植后各組大鼠NSS神經功能評分比較 見表2。

表2 各組大鼠不同時間點NSS神經功能評分比較

由表2可見，對照組各時點NSS神經功能評分均低于其他3組。3組TBI大鼠比較，PBS組NSS神經功能評分均高于其余兩組，其中第20、30天差異有統計學意義（P＜0.05）；GAD+NSCs組凋亡陽性細胞數稍低于NSCs組，其中第10、20、30天差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

實驗研究證明，移植轉基因NSCs對中樞神經系統疾病的治療有非常積極的作用[9]。本文結果顯示，GAD+ NSCs組細胞凋亡數量最少。表明轉基因細胞在移植到顱腦損傷部位后能夠存活并且分化成神經細胞發揮作用，不僅能補充神經細胞數量，同時抑制了神經細胞的凋亡。

近年來的研究表明，在TBI后，受損部位的神經細胞會產生過量的興奮性氨基酸（excitatory amino-acid，EAA）如：谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、甘氨酸（Gly）等，EAA類神經遞質兼有對神經元的興奮作用和神經毒性作用，興奮性強則毒性也強[10]，這些氨基酸能引起多種病理損害，致神經細胞水腫、空泡樣變性和死亡；而抑制類氨基酸(inhibitory amino-acid，IAA)、γ-氨基丁酸（gamm a-aminobutyric acid,GABA）、牛磺酸（taurine, Tau）和丙氨酸（alanine,Ala）等則起到腦保護作用[11]。

以谷氨酸為代表的過量EAA與相應受體結合，一方面導致大量單價離子Na+、Cl-內流和K+外流,造成細胞水腫、變性和死亡；另一方面致大量Ca2+內流,使胞內Ca2+濃度升高,激活酯酶和蛋白酶,使胞內脂質和蛋白質分解，線粒體不可逆性壞死,最終使細胞死亡。腦損傷后組織損傷和廣泛的膜去極化使谷氨酸超量釋放,重攝取也發生障礙，除產生神經毒作用外,還增強了組織對缺血的敏感[12]。GAD基因修飾的NSCs的過量表達，一方面谷氨酸脫羧酶催化谷氨酸生成GABA，降低了谷氨酸的含量，另一方面生成的GABA作用于受體可抑制EAA釋放和鈣離子內流，有降低顱內壓、升高平均動脈壓和腦灌注壓和減小腦缺血梗死灶的作用。

有研究報道人類神經干細胞以及胚胎干細胞移植到腦損傷疾病小鼠的腦中，能夠很好地存活及分化[13]。本研究結果顯示，GAD+NSCs組和NSCs組在第10、20、30天神經功能評分均低于PBS組（P＜0.05）；GAD+NSCs組從第7天神經功能評分低于NSCs組（P＜0.05），表明在NSCs移植后14d，大鼠的神經功能有明顯改善，而在轉基因NSCs移植后7d大鼠神經功能就有明顯改善，這說明盡管NSCs本身可以促進損傷組織的修復，但表達GAD的轉基因NSCs可以更早地發揮神經保護作用。GAD可通過催化Glu生成GABA，而GABA屬于保護性氨基酸類神經遞質，可以促進顱腦損傷后腦功能的恢復[3]。

本研究表明，GAD修飾的NSCs移植到大鼠顱腦損傷部位后不僅可以在損傷的腦組織中存活，而且能夠促進TBI后大鼠神經功能的恢復，為TBI疾病的治療打下進一步的基礎。

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Neural stem cells modified by GAD in treatment of rat traumatic brain injury AI Lingling,TAN Xiaodong,YANG Lulu.

Glutamic acid decarboxylase Neural Stem Cells Traumatic Brain Injury

2012-09-17）

（本文編輯：田云鵬）

311201 杭州市蕭山區第一人民醫院神經內科（艾玲玲）；南京師范大學生命科學學院細胞生物研究所（譚曉東、楊露露）

【 Abstract】Objective To investigate the effect of neural stem cells (NSCs)modified by glutamic acid decarboxylase (GAD)on rat traumatic brain injury. Methods GAD-transfected neural stem cells (GAD+NSCs group),wild neural stem cells (NSCs group)and PBS(PBS group)were transplanted into rats with traumatic brain injury.Neurological function was assessed by neurological severity score(NSS)in all groups after transplantation.TUNEL was employed to observe the cell apoptosis. Results The values of NSS in GAD+NSCs and NSCs groups were significantly lower than that of PBS group at 10h,d20 and d30 after cell transplantation(P＜0.05).The NSS scores in GAD+NSCs group were lower than those in NSCs group at d20 and d30(P＜0.05).At each time point,the rate of cell apoptosis in transplantation group was lower than that in model group(P＜0.05). Conclusion Neural stem cells modified by GAD can protect neural function in rats with traumatic brain injury.