腦膠質瘤中脂肪酸酰胺水解酶的表達及意義

張小林 蔣峰 龔清永 韓麗君 任杰 林志雄 傅瑾

腦膠質瘤中脂肪酸酰胺水解酶的表達及意義

張小林 蔣峰 龔清永 韓麗君 任杰 林志雄 傅瑾

目的 研究內源性大麻素代謝酶脂肪酸酰胺水解酶（FAAH）在腦膠質瘤組織中的表達情況及其與膠質瘤病理級別的關系，探討其臨床意義。 方法 選取首次手術切除并經病理檢查證實的腦膠質瘤標本23例，其中WHOⅠ級1例，Ⅱ級7例，Ⅲ級5例，Ⅲ～Ⅳ級2例，Ⅳ級8例。另取8例因顱腦外傷行內減壓術切除的正常腦組織作為對照。應用實時熒光定量PCR和高效液相色譜-質譜聯用技術分別檢測各組織標本中FAAH mRNA和FAAH活性的表達。 結果 FAAH mRNA、FAAH活性在低級別（WHOⅠ～Ⅱ級）和高級別（WHOⅢ～Ⅳ級）腦膠質瘤組織中的表達水平較正常腦組織明顯降低，差異有統計學意義（均P＜0.01），且隨著腫瘤病理級別的增高而降低，與腫瘤的病理分級呈負相關（均P＜0.01）。FAAH mRNA與FAAH活性的表達水平呈正相關（P＜0.01）。 結論 FAAH可能參與了腦膠質瘤的發生、發展過程，檢測FAAH的表達可評價腦膠質瘤的生物學行為，為腦膠質瘤的臨床治療和預后判斷提供參考。

大麻素 花生四烯酸乙醇胺 FAAH 膠質瘤

腦膠質瘤是最常見的原發性中樞神經系統腫瘤，據報道約占原發性腦腫瘤的45%～50%，患者的5年生存率僅為12%～15%[1]。近年來，大量研究表明內源性大麻素及其相關藥物能在體內外實驗中抑制膠質瘤的生長[2]。目前，尚未見腦膠質瘤中內源性大麻素代謝酶脂肪酸酰胺水解酶（FAAH）與腫瘤病理級別關系的研究，本文擬通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和高效液相色譜-質譜聯用技術（HPLC-MS）檢測FAAH在腦膠質瘤組織和正常腦組織中的表達，探討其與腫瘤病理級別的內在聯系，為膠質瘤的治療和預后判斷提供參考，也為內源性大麻素系統抗膠質瘤的研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 組織標本 選擇福建醫科大學附屬第一醫院神經外科2007—2008年首次手術切除并經病理檢查證實的腦膠質瘤組織標本23例，患者臨床資料齊全，術前均未行放療、化療和免疫治療，無其他神經系統疾病史、精神病史和毒物接觸史。正常腦組織標本8例作為對照，均為腦外傷行內減壓術切除的腦組織。一部分標本用液氮速凍，-80℃冰箱保存；另一部分用甲醛溶液固定，作常規病理組織學和免疫組織化學染色檢測。參照2007年WHO神經系統腫瘤分類分級標準，其中Ⅰ級1例，Ⅱ級7例，Ⅲ級5例，Ⅲ～Ⅳ級2例，Ⅳ級8例。本研究將組織標本分為3組：正常腦組織組（8例）、低級別腦膠質瘤組（Ⅰ～Ⅱ級，8例）和高級別腦膠質瘤組（Ⅲ～Ⅳ級，15例）。1.2 qRT-PCR檢測 （1）組織總RNA的提?。阂旱卵欣彿鬯榻M織塊。按照Trizol試劑說明書推薦的步驟操作。按照文獻[3]報道的方法檢測RNA的濃度、純度和完整性。（2）cDNA的合成：使用ToYoBo公司的ReverTra Ace qPCR RT Kit進行逆轉錄反應，所有操作均在冰上完成，總反應體系為10μl。取總RNA1μg，加DEPC水至7μl，65℃加熱5min，冰上放置3min，依次加入5xRT Buffer 2μl、RT Enzyme mix 0.5μl、Primer mix 0.5μl，混勻后37℃15min、98℃5min、4℃10min，即得到逆轉錄產物（cDNA），加滅菌純水稀釋至10倍，-20℃保存備用。⑶rt-PCR：以逆轉錄反應產物為模板進行擴增反應。PCR所用引物由Oligo 6軟件設計，上海生工生物工程有限公司合成。FAAH引物正義為：5′-AAAACCGTGATTGCCCAGTG-3′，反義為：5′-TCCCCAAAGTAGCCCCTGTAA-3′；GAPDH引物正義為：5′GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，反義為：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。PCR所用試劑為TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒,反應體系為20μl：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10μl、Forward Primer 0.8μl、Reverse Primer 0.8μl、ROX Reference Dye 0.4μl、cDNA 8μl。置于ABI7300熒光定量PCR儀上按下列條件擴增：95℃30s預變性，95℃5s、60℃31s，擴增40個循環，然后95℃15s、60℃1min、95℃15s。PCR完成后，由ABI 7300 System SDS Software軟件進行分析，在調整基線循環和計算域值后，根據標準曲線，計算出待測基因的表達水平，將待測基因表達量/管家基因GAPDH表達量的比值進行統計分析。

1.3 FAAH活性測定 按照BCA法測定組織蛋白的濃度，用80 μg蛋白進行FAAH活性測定。在50 mM Tris-HCL（pH8.0）含有0.05%BSA緩沖液內加入80 μg蛋白、25 M AEA，混合均勻，在37℃下反應30 min。以上反應中加入含有1 nmol 17∶0脂肪酸內標的甲醇終止液200μl終止反應，HPLC-MS分析水解反應產物含量。HPLC-MS條件：Agilent 1200 series型號液相色譜儀，ABI 3200 Q TrapLC/MS/MS system型號質譜儀，Agilent ZOR BAX Eclipse XDB-C18column（4.6mm×150 mm，1.8 μm）型號液相色譜柱，柱溫保持在40℃，進樣量5μl，流動相A：水（含0.25%醋酸和5 mM醋酸銨），流動相B：甲醇，流速0.6 ml/min，95%B洗脫5 min。質譜為ESI（-）離子源，干燥氣為N2，溫度350℃，掃描質量范圍50～400 amu。結果以17∶0脂肪酸m/z=269作為內標對FAAH水解產物FAAH m/z=303進行定量分析。1.4 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件。計量數據以 表示，組間比較采用 Kruskal-Wallis H檢驗。FAAH mRNA、FAAH活性與腦膠質瘤病理級別的相關性采用Spearman相關分析。FAAH mRNA與FAAH活性的關系采用Pearson相關分析。

2 結果

2.1 FAAH表達水平和FAAH活性在正常腦組織和膠質瘤組織中的表達 見表1。

表1 正常腦組織和各級別膠質瘤組織中FAAH表達水平的比較

由表1可見，所有組織中均能檢測到FAAH mRNA的表達，在正常腦組織中呈高表達，而在腦膠質瘤組織中呈低表達，差異有統計學意義；并且，FAAH mRNA的表達量與膠質瘤的病理級別呈負相關（r=-0.77，P＜0.01）。此外，所有組織中還可檢測到FAAH活性，正常腦組織FAAH活性明顯高于腦膠質瘤組織，差異也有統計學意義；并且，FAAH活性與膠質瘤的病理級別也呈負相關（r=-0.68，P＜0.01）。

2.2 FAAH表達水平與FAAH活性的關系 將每個組織樣本的FAAH mRNA/GAPGH mRNA的比值與該組織的FAAH活性進行Pearson相關分析（圖1），結果顯示，FAAH表達水平與FAAH活性之間具有明顯的正相關關系（r=0.598，P＜0.01）。

圖1 FAAH表達水平與FAAH活性的關系

3 討論

大麻（Marijuana，植物學名Cannabissativa）其主要的活性成分是Δ9-四氫大麻酚（deltatetrahydrocannabinol，Δ9-THC），既是毒品，又是具有抑制細胞生長、抗炎癥、抑制腫瘤生長的治療藥物[4]。大麻素受體是指對大麻類物質如Δ9-THC有應答作用的受體，廣泛分布于人體各組織系統。內源性大麻素是指機體內產生的具有與Δ9-THC相似的空間三維結構，并能與大麻素受體相結合而發揮生物學效應的花生四烯酸的衍生物。迄今為止，已經鑒定出5種內源性大麻素[5]：花生四烯酸乙醇胺（anandamide，AEA），2-花生四烯酸甘油（2-arachidonylglycerol，2-AG），2-花生四烯酸甘油醚（2-arachidonylglycerolether，2-AGE），油酰乙醇胺（oleoylethanolamide，OEA），花生四烯酸多巴胺（N-arachidonyldopamine，NADA）。

AEA是第一個被發現并從體內分離出來的內源性大麻素。AEA可通過增加神經酰胺從頭合成抑制人膠質瘤U251細胞的增殖并誘導其發生早期凋亡[6]；另還可作用于辣椒素受體，增加細胞內鈣濃度，激活環氧合酶，釋放細胞色素C和激活天冬氨酸蛋白水解酶caspase 3，誘導人神經母細胞瘤和C6膠質瘤細胞的凋亡[7]。Jacobsson等[8]發現，AEA可激活大麻素受體和辣椒素受體，引起膠質瘤細胞的氧化應激；激活鈣蛋白酶（calpain)，引起細胞內鈣超載而抑制C6膠質瘤細胞的增殖。1971年，Folkman首次提出腫瘤的生長和轉移是一個依賴血管形成的過程，因此，阻止新生血管的形成成為抑制腫瘤生長的一個基本的治療策略[9]。AEA通過抑制成纖維細胞生長因子（bFGF）引起的血管內皮細胞的增殖、毛細樣管道的形成和基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)的降解活性來抑制腫瘤新生血管的形成[10]。

哺乳動物體內AEA主要在神經細胞內由FAAH直接降解成花生四烯酸和乙醇胺[11]。FAAH是一種屬于絲氨酸水解酶家族的膜酶，由579個氨基酸組成，主要定位于微粒體和線粒體，廣泛分布于機體的各個部位,在大腦和肝臟中的濃度較高[12]。迄今為止，關于AEA的水解酶FAAH與腫瘤發生或發展相關的研究甚少。在小鼠的結腸癌模型中，抑制FAAH的活性能增加AEA的含量，通過促進異常細胞的凋亡，從而減少了結腸組織中異常腺窩（早期癌前病變）的形成[13]。Endsley等[14]學者運用組織芯片技術發現，相對于正常的前列腺組織，前列腺癌組織FAAH的表達增加了。更為有趣的是，高表達FAAH蛋白的PC3前列腺癌細胞2-AG的表達增加了，增強了PC3細胞的侵襲和遷移能力；相反的是，通過RNAi技術敲除LNCaP前列腺癌細胞的FAAH基因，則抑制了前列腺癌細胞的侵襲。此外，FAAH的抑制劑CAY10401也能減弱前列腺癌細胞的侵襲力，并能進一步減弱轉染了FAAH siRNA的LNCaP細胞的侵襲能力和遷移活動。隨后，Thors研究團隊[15]對412例前列癌患者的石蠟包埋標本進行免疫組化檢測，發現FAAH的免疫反應性（FAAH-IR）與Gleason評分、樣本中所含腫瘤細胞的百分數、磷酸化的EGFR含量（前列腺癌預后指標）和人表皮生長因子受體2含量呈正相關；另外，也發現281例處于癌癥終末期僅接受姑息治療患者的FAAH-IR與患者的預后呈現出明顯的負相關，多變量Cox比例風險回歸分析提示FAAH-IR可作為前列腺癌的預后指標。胰腺癌組織中，低表達FAAN蛋白的患者的中位生存期為10個月，而中等表達和高表達FAAH蛋白的患者的中位生存期為19.1個月，這表明FAAH蛋白的表達水平與患者的預后有關[16]。

本研究的結果顯示，腦膠質瘤組織中無論在基因水平還是在蛋白水平均可檢測到FAAH的表達，FAAH的表達明顯低于正常腦組織，并且FAAH的表達水平與膠質瘤的病理級別呈負相關。由此可以推測，FAAH可能參與了腦膠質瘤的發生、發展過程，檢測FAAH的表達可評價腦膠質瘤的生物學行為，為腦膠質瘤的臨床治療和預后判斷提供參考。此外，本研究結果為內源性大麻素系統抗膠質瘤的應用提供了一定的理論依據，FAAH基因可能成為腦膠質瘤治療的一個新藥理學靶點，因為目前已有研究發現FAAH抑制劑AA-5-HT能抑制C6膠質瘤細胞的增殖[8]。

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Expression of fatty acid amide hydrolase in brain glioma and its significance

ZHANG Xiaolin,JIANG Feng,GONG Qingyong,et al.

Department of Neurosurgery,Zhoushan Hospital,Zhoushan 316021,China

【 Abstract】Objective To investigate the expression of endocannabinoid metabolic enzyme fatty acid amide hydrolase（FAAH）in human brain glioma tissues and its clinicopathological significance. Methods Twenty-three patients with brain glioma,including one case with grade I,7 grade II,5 grade III，2 grade III～IV and 8 glioblastoma,undergoing surgical excision were enrolled in the study;and 8 samples of normal brain tissues from patients undergoing decompression operation due to cerebral hernia served as controls.qRT-PCR and HPLC-MS were used to detect the mRNA and the activity of FAAH,respectively. Results The expression of mRNA and activity of FAAH was significantly higher in low grade(gradeⅠ～Ⅱ)and high grade (gradeⅢ～Ⅳ)brain glioma than those in the normal brain tissues(P＜0.01).The expression of FAAH mRNA was positively correlated with the FAAH Activity，and both were negatively correlated with the pathological grades(P＜0.01). Conclusion FAAH may be involved in the occurrence and development of brain glioma;the detection of FAAH expression may be of value in evaluation of biological behavior and prognosis of brain glioma.

Cannabinoid Anandamide FAAH Glioma

2012-03-14）

（本文編輯：沈叔洪）

衛生部科學研究基金-福建省衛生教育聯合攻關計劃資助項目（WKJ2008-2-45）

316021 浙江省舟山醫院、溫州醫學院附屬舟山醫院神經外科（張小林、蔣峰）；福建醫科大學附屬第一醫院神經外科（龔清永、林志雄）；廈門大學醫學院藥學系（韓麗君、任杰、傅瑾）

傅瑾、林志雄，E-mail:lzx1967@sina.com