初發(fā)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者調節(jié)性T細胞和Th17細胞的檢測及意義

馬紀林 劉小賢 汪衛(wèi) 鄭紅霞 蔡龍 施華萍 周紅娟 于健寧

●論 著

初發(fā)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者調節(jié)性T細胞和Th17細胞的檢測及意義

馬紀林 劉小賢 汪衛(wèi) 鄭紅霞 蔡龍 施華萍 周紅娟 于健寧

目的 觀察初發(fā)系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者外周血調節(jié)性T細胞（Treg）和Th17細胞的變化，探討其臨床意義。方法 檢測15例初發(fā)SLE患者（活動組11例，非活動組5例）及10例健康對照者（對照組）的外周血CD4+CD25highTreg、Th17細胞占CD4+的比例，分析兩種細胞的比率與疾病活動指數（SLEDAI）的相關性。結果 初發(fā)SLE患者外周血CD4+CD25highTreg和Th17細胞的比例與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05），與SLEDAI無相關性（均P＞0．05）。CD4+CD25highT細胞與Th17細胞的比率在活動組患者下降尤為明顯（P＜0．05），且與SLEDAI呈明顯的負相關（P＜0．05）。 結論 初發(fā)的活動性SLE患者外周血Treg與Th17細胞的比率明顯下降，并與疾病活動密切相關，兩群細胞的失衡可能在SLE發(fā)病機制中起重要的作用。

紅斑狼瘡 系統(tǒng)性 調節(jié)性T細胞 Th17細胞

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是具體病因尚未明確的一種常見的自身免疫性疾病，臨床特征為抗原-抗體的免疫復合物沉積于器官引起多種臨床表現。免疫系統(tǒng)紊亂在SLE發(fā)病中占主導地位。調節(jié)性T細胞（regulaory T cells，Treg）和Th17細胞是新近發(fā)現的兩群CD4+T細胞亞群，其中Treg具有免疫抑制和免疫無能的特征，可“主動”地抑制免疫反應[1]。Th17細胞為促炎癥細胞，通過分泌IL-17A和IL-17F，引起組織的免疫炎癥[2-3]。兩群細胞間的失衡導致自身免疫病的發(fā)生[4]。我們在前期研究中發(fā)現Treg與Th17的失衡在活動性SLE中明顯降低，并與疾病明顯相關，但在初發(fā)SLE患者中的作用尚不明確[5]。本研究采用流式細胞儀檢測初發(fā)SLE患者外周血CD4+CD25high-Treg和Th17細胞占CD4+細胞的比例，分析兩者的比率與疾病活動的相關性以及Treg與Th17細胞的免疫失衡在初發(fā)SLE發(fā)病機制中的作用。

1 對象和方法

1.1 對象 我院風濕免疫腎臟科2008-09—2011-12住院或門診收治未經治療的初發(fā)SLE患者15例，男1例，女14例，年齡22～38歲。診斷均符合1997年美國風濕病學會制定的SLE診斷標準。采用SLE疾病活動指數（SLEDAI）將其分組（SLEDAI≈6分為活動組，＜6分為非活動組），其中活動組10例，SLEDAI為（14.70±5.12）分，非活動組5例，SLEDAI為（2.60±1.14）分，兩組評分比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。選擇同時期體檢的健康者10例為對照組，男1例，女9例，年齡20～37歲。兩組性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。本研究遵循倫理學標準，并得到本單位醫(yī)學倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 CD4+CD25highT細胞的培養(yǎng)與標記 取肝素抗凝全血3ml，分別加入20μl的PE標記的鼠抗人CD4單抗和異硫氰酸熒光素（FITC）標記的鼠抗人CD25單抗，并設立同型對照管。混勻后避光15min，再加入1ml紅細胞裂解液，37℃孵育10min，離心棄去上清液，PBS洗滌3次。

1.2.2 Th17細胞的培養(yǎng)與標記 空腹抽取初發(fā)SLE患者和健康對照組靜脈血，肝素抗凝，調整細胞濃度為1× 106個/ml，接種至24孔培養(yǎng)板，每孔加入的50ng/ml佛波酯和750ng/ml的離子霉素，孵育1h后加入10μg/ml莫能霉素，在37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱孵育4h后收集細胞，取500μl細胞于流式專用試管中，分為測定管和同型對照管，加入20μl的PE標記的鼠抗人CD4單抗，4℃避光孵育30min，PBS洗滌2次，固定液室溫避光固定反應20min后離心棄去上清液，PBS洗滌2次。加入破膜劑進行細胞打孔，離心棄去上清液后進行細胞因子染色。測定管加入0.5μl FITC標記的IL-17A，對照管加入同型對照，4℃避光孵育30min。藻紅素（PE）標記的鼠抗人CD4，FITC標記的鼠抗人CD25及同型對照均購自美國BD公司，FITC標記的鼠抗人的IL-17A及同型對照購自美國eBioscience公司。佛波酯、離子霉素和莫能霉素均購自美國Sigma-Aldrich公司，RPMI 1640購自美國Gibco公司。

1.2.3 流式細胞儀檢測 Epics XL-MCL型流式細胞分析儀（Beckman-Coulter公司），按常規(guī)操作進行，EXPO32軟件分析結果，根據正向散射光和側向散射光以淋巴細胞群設門，分別測定SLE患者和健康對照組CD4+CD25highT細胞和Th17細胞占CD4+T細胞的比例，其中CD4+CD25highT細胞定義為2倍于CD4+CD25+T細胞的平均熒光強度的細胞（圖1）。

圖1 流式檢測CD4+CD25highT細胞的設門

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SigmaStat3.5統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析（AVONA），兩組間比較采用t檢驗，變量間的相關關系采用Pearson相關分析。

2 結果

初發(fā)SLE患者及對照組外周血CD4+CD25highTreg細胞與Th17細胞的比率及與疾病的相關性 見表1。

由表1可見，初發(fā)SLE組和對照組外周血CD4+CD25highTreg細胞的比例比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。其中在初發(fā)SLE患者中，活動組和非活動組外周血CD4+CD25highTreg細胞的比例比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。活動組和非活動組SLE與對照組比較，差異也無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。初發(fā)SLE患者外周血CD4+CD25highT細胞的比例與SLEDAI無相關性（r=-0.403，P＞0.05，圖2A）。

表1 初發(fā)SLE組與對照組的Treg和Th17細胞的比例及兩者的比率

初發(fā)SLE組和對照組外周血Th17細胞的比例比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。其中在初發(fā)SLE患者中，活動組、非活動組外周血Th17細胞的比例比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），活動組、非活動組與對照組比較，差異也無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。初發(fā)SLE患者外周血Th17細胞的比例與SLEDAI無相關性（r= 0.471，P＞0.05，圖2B）。

圖2 CD4+CD25highT細胞（A）和Th17細胞（B）與SLEDAI的相關性分析

初發(fā)SLE組和對照組外周血CD4+CD25highTreg細胞與Th17細胞的比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。其中在初發(fā)SLE患者中，活動組、非活動組外周血CD4+CD25highTreg細胞與Th17細胞的比率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。初發(fā)SLE患者CD4+CD25highTreg細胞與Th17細胞的比率與SLEDAI呈負相關性（r=-0.527，P＜0.05，圖3）。

圖3 CD4+CD25high/Th17細胞比率與SLEDAI的相關性分析

3 討論

本研究發(fā)現Treg與Th17細胞的比率在初發(fā)的活動期SLE患者中下降明顯，并與SLEDAI呈密切相關，但未發(fā)現Treg和Th17細胞占CD4+T細胞的比例在初發(fā)SLE的異常及與疾病活動無相關性，揭示Treg與Th17細胞之間的免疫失衡在初發(fā)SLE組發(fā)病中起到一定的作用。

SLE是一種常見的自身免疫性疾病，累及多個器官導致一系列的臨床表現，其發(fā)病機制主要是免疫耐受的失衡，機體產生大量的自身抗體，導致抗原抗體復合物形成。免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定需要免疫耐受來維持，免疫耐受可分為中樞性和外周性免疫耐受。Treg是一群能夠“主動”地抑制自身反應性T細胞的免疫反應，抑制細胞的活化和細胞因子的分泌[1]，是維持外周免疫耐受的最重要機制。1995年，Sakaguchi等[6]首次定義高表達IL-2受體α鏈（CD25）的CD4+T細胞為Treg，其在體外通過細胞間的直接接觸發(fā)揮免疫抑制作用，在體內可能還通過細胞因子發(fā)揮其功能，隨著研究的不斷深入，發(fā)現多箭頭轉錄因子Foxp3是小鼠Treg的標記物和功能調節(jié)基因[7]，然而，在人活化的T細胞中也能短暫表達Foxp3[8]，說明其不是人Treg的特異標記物，目前仍認為CD4+CD25highT細胞是人較特異的標記物[9]，因此本研究選擇此群細胞來定義Treg。Th17細胞是一群促炎癥細胞，能分泌IL-17A、IL-17F及IL-21，導致組織的炎癥反應。在體外由TGF-β和IL-6誘導產生Th17細胞，其中維甲酸孤兒核受體RORγt是Th17細胞分化的重要因子[2-3]。Treg和Th17細胞在自身免疫性疾病中的作用越來越受到重視，如類風濕關節(jié)炎，多發(fā)性硬化等。

本研究發(fā)現初發(fā)SLE組Treg占CD4+T細胞的比例并不降低，與SLEDAI無相關性。已有大量的研究發(fā)現在活動性SLE患者外周血Treg的數目減少[9-10]，但有少數研究發(fā)現其比例是正常的[11]，相反的，也有研究發(fā)現活動性SLE患者的Treg是上升的[12]。以上結果說明Treg在SLE中的作用不盡一致，可能與Treg的標記物選擇有關。接著我們分析初發(fā)SLE患者外周血Th17細胞的比例，同樣也未發(fā)現有臨床意義。Wong等[14]發(fā)現SLE患者Th17細胞在活動期明顯增加，并與SLEDAI呈正相關。最近的研究發(fā)現Th17細胞在SLE中有一定的作用，但是確切機制尚不明確[15]。

本研究中的重要發(fā)現是初發(fā)的活動性SLE患者存在Treg和Th17細胞的比率明顯下降，與疾病活動呈明顯的負相關。Yang等[16]也發(fā)現活動性SLE患者存在Th17細胞的擴增，且伴隨Treg的下降，我們的前期研究[17]發(fā)現經治療后臨床緩解的活動性SLE患者的SLEDAI明顯下降，伴隨Treg和Th17細胞的失衡被逆轉。以上結果表明Treg與Th17細胞的免疫失衡是初發(fā)活動性SLE的臨床特征和參與其發(fā)生和發(fā)展。Treg和Th17細胞的分化存在相互制約，例如IL-6聯合TGF-β能誘導Th17細胞的分化，而IL-6抑制Treg的體外抑制功能。同樣，IL-2是Treg誘導的必需細胞因子，也是維持Treg功能的重要因素，相反IL-2能抑制Th17細胞的分化[21]。因此，我們認為初發(fā)SLE患者存在異常的免疫環(huán)境導致Treg和Th17細胞的失衡。

綜上所述，我們發(fā)現初發(fā)活動性SLE患者存在Treg與Th17細胞的比率降低，可輔助作為判斷疾病活動的指標。兩群細胞間的免疫失衡參與初發(fā)SLE的發(fā)生和發(fā)展。本研究的結果提示我們可以通過調控Treg和Th17細胞的平衡來治療SLE等自身免疫性疾病。

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Clinical significance of regulatory T cells and Th17 cells in the patients with new-onset systemic lupus erythematosus

Objective To determine the ratio of CD25 and IL-17A cells in peripheral CD4+T cells of new-onset patients with systemic lupus erythematosus(SLE)and to assess their clinical significance．Methods Fifteen new-onset patients with systemic lupus erythematosus,including 10 active cases and 5 inactive cases,and 10 healthy individuals were enrolled in the study．The ratio of CD25 and IL-17A cells in peripheral CD4+T cells was analyzed by flow cytometry．Disease activity was assessed by systemic lupus erythematosus activity index(SLEDAI)．Results There was no significant difference in frequency of CD4+CD25highT cells and Th17 cells between SLE patients and normal controls(P＞0．05)．The frequency of CD4+CD25highT cells and Th17 cells was not correlated with SLEDAI scores of patients(P＞0．05)．The ratio of CD4+CD25highT cells and Th17 cells in active SLE patients was significantly lower than that in inactive patients and healthy controls (P＜0．05)and it was negatively correlated with SLEDAI scores(P＜0．05)．Conclusion The results indicate that the imbalance of Treg cells and Th17 cells may be involved in the pathogenesis of SLE．

Lupus erythematosus Systemic Regulatory T cells Th17 cells

2012-08-01）

（本文編輯：楊麗）

國家自然科學基金（81274161，81001307），浙江省自然科學基金（Y2090918）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科學研究基金計劃項目（2012RCA046，2011KYA137，2007A162）；杭州市科技發(fā)展計劃項目（20080333Q28，20110733Q15，20110833B26）

310003 杭州市紅十字會醫(yī)院風濕免疫腎臟科

馬紀林，E-mail：majilin080808@gmail.com