神經激肽1受體拮抗劑對大鼠腦缺血再灌注的神經保護作用

封菲 王曉楠 章順榮 丁美萍 高越

神經激肽1受體拮抗劑對大鼠腦缺血再灌注的神經保護作用

封菲 王曉楠 章順榮 丁美萍 高越

目的 觀察大鼠局灶性腦缺血再灌注后神經激肽1受體拮抗劑對腦梗死體積、腦組織含水量及神經行為學變化的影響，探討減輕神經源性炎癥反應對腦缺血再灌注的保護作用。 方法 將54只大鼠分為藥物組、假手術組、對照組，用線栓法建立右側大腦中動脈缺血再灌注大鼠模型，藥物組和對照組大鼠在再灌注時經尾靜脈分別注入神經激肽1受體拮抗劑及生理鹽水，假手術組只分離右側頸總、頸內、頸外動脈。缺血再灌注后24h時采用免疫組化法檢測P物質表達，氯化三苯基四氮唑染色法測定腦梗死體積，干-濕稱重法檢測腦組織含水量；分別于再灌注24h及72h時利用轉棒試驗和肢體不對稱試驗檢測神經行為學變化。 結果腦缺血再灌注后24h大鼠腦缺血區P物質的表達明顯升高，腦組織含水量明顯增加。藥物組與對照組比較，腦組織含水量減少，神經功能改善。 結論 神經激肽1受體拮抗劑可通過抑制神經源性炎癥反應而達到缺血再灌注損傷時的腦保護作用。

【關鍵詞】缺血再灌注 P物質 腦水腫 神經源性炎癥反應

缺血性腦卒中患者的預后與腦水腫是否形成密切相關，現已證實外周組織水腫形成與神經肽物質釋放引起血管通透性增加密切相關[1]，這一炎癥過程稱之為神經源性炎癥，其主要特點為血管擴張和血漿蛋白外滲[2]。在神經肽物質中目前認為P物質（substance P，SP）是神經源性炎癥反應的始動因素并起到最關鍵的作用[3]。SP受體中神經激肽1受體具有更高的親和性，關于在急性中樞神經系統損害時應用神經激肽1受體拮抗劑的研究很少。本研究擬通過檢測大鼠腦缺血再灌注后缺血半暗帶神經源性炎癥反應相關免疫指標SP的表達變化、腦水腫程度、腦梗死體積及神經功能的改變，探索神經激肽1受體拮抗劑在缺血再灌注損傷中的保護作用。

1 材料和方法

1.1 動物模型制備及處理 成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠54只（體重250～300g，清潔度Ⅱ級，浙江省醫學科學院動物中心提供），隨機分為藥物組、假手術組及對照組3組，每組18只。每組再分為3亞組（每亞組6只），分別用于檢測大鼠腦缺血再灌注24h腦組織SP的表達及腦梗死體積、再灌注24h神經行為學評估及腦組織含水量和再灌注72h神經行為學評估。用10%水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉后，按照Bederson等的方法制作線栓法大鼠腦缺血再灌注模型，手術前后大鼠肛溫維持（37.0±0.5）℃。缺血90min后抽提栓線至頸外動脈殘端內進行再灌注。藥物組大鼠于再灌注時立即尾靜脈給予神經激肽1受體拮抗劑N-乙酰-L-半月光氨酸（25μmol/kg）[4]。假手術組大鼠手術時只分離右側頸總、頸內及頸外動脈，不插入栓線，并于再灌注時予1ml 0.9%氯化鈉注射液。

1.2 試劑和儀器 神經激肽1受體拮抗劑（國準字號H20053574）購自天津天安藥業股份有限公司，兔抗鼠SP多克隆抗體購自美國Sigma公司，SP免疫組化試劑盒及DAB顯色系統購自北京中杉金橋生物技術公司，氯化三苯基四氮唑購自中國醫藥上海化學試劑公司，Olympus-CH2顯微鏡購自日本Olympus光學工業株式會社，Rotarod儀由香港中文大學器械服務公司提供。

1.3 免疫組化技術檢測SP的分布 大鼠腦缺血再灌注24h時取腦連續冠狀切片得第4腦片（厚2.0mm），常規脫水、透明、浸蠟、包埋、用切片機連續5μm厚冠狀切片。石蠟切片經常規脫蠟、水化、煮沸法修復，過氧化氫阻斷，滴加一抗（工作濃度1∶1 000），根據免疫組化試劑盒說明書對切片標本進行操作，予DAB顯色，自來水沖洗后蘇木素復染，脫水、封片，表達SP處在光鏡下為棕黃色物質。

1.4 腦梗死體積測定 各組大鼠于再灌注24h用200ml0.9%氯化鈉注射液經心臟灌流后快速斷頭取腦，去除嗅球和腦干，連續冠狀切片（厚2.0mm）。取第4腦片轉入-80℃冰箱保存用于免疫組化，其余腦片放入0.5%的氯化三苯基四氮唑溶液，37℃孵育箱中孵育30min后，多聚甲醛固定24h。攝片后采用Medbrain 2.0處理系統（浙江大學醫學院神經生物學實驗室提供），計算每一腦片正常側及缺血側腦半球紅染（未缺血）的面積，兩者相減得到矯正后的缺血面積。面積乘以厚度，并迭加每片數據后得到腦梗死灶體積百分比，采用單盲法。

1.5 腦組織含水量測定 利用干濕稱重法。大鼠快速斷頭取腦，取右側大腦半球用電子天平獲取濕重，置入100℃恒溫干燥箱內48h再獲取干重，腦組織含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.6 神經行為學評估

1.6.1 轉棒試驗 將各組大鼠于時間觀察點放于Rotarod儀上，Rotarod的轉速在5min之內勻速增加到40r/ min，若大鼠從Rotarod儀上落下，或緊抓于Rotarod上連續2圈不作運動則實驗結束，記錄大鼠在Rotarod上運動的時間，一旦大鼠從Rotarod儀上落下，下面的電刺激器將給大鼠電刺激促使大鼠盡最大能力在Rotarod儀上運動。手術前3d開始訓練大鼠，手術前1 d對每只大鼠進行3次測試，取最長持續時間為基線。觀察點對每只大鼠進行3次測試，取其最長持續時間與正常基線值的百分比作為反映大鼠運動功能的指標。

1.6.2 肢體不對稱試驗 正常大鼠在玻璃圓桶中會不時站立，用雙側前肢交替或同時觸及桶壁，應用雙側前肢的頻率應該相等，有缺血性腦損傷的大鼠偏癱側肢體應用較少。觀察并記錄雙側前肢的應用情況，對每只大鼠每次記錄20次活動，以肢體應用的百分率計算最后得分，得分=（R-L）/（R+L+B）×100%[R：右側前肢（健側）獨立應用次數；L：左側前肢（患側）獨立應用次數；B：雙前肢同時應用次數]。

1.7 統計學處理 采用SPSS 11.0統計軟件，計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，顯示方差齊性的資料進一步采用SNK檢驗作兩兩比較，若方差不齊用Dunnett’s檢驗。

2 結果

2.1 免疫組化檢測 假手術組及對照組的未缺血側大腦半球基本未見陽性細胞，而對照組的右側大腦半球皮質缺血區可見胞質呈棕黃色的SP免疫陽性細胞，在半暗帶區域及血管周圍尤其明顯。

2.2 大鼠腦梗死體積及腦組織含水量測定 藥物組及對照組大鼠腦梗死體積較假手術組明顯增加，藥物組與對照組比較，梗死體積差異無統計學意義（P＞0.05）。假手術組大鼠腦梗死體積和腦組織含水量均較對照組減少，藥物組與對照組比較腦組織含水量減少（P＜0.05），見表1。

表1 3組大鼠缺血再灌注后24h腦梗死體積和腦組織含水量的比較（%）

2.3 神經行為學評估 轉棒試驗和肢體不對稱試驗結果均提示假手術組較對照組神經行為功能明顯改善（P＜0.05），提示腦缺血再灌注造成大鼠神經行為功能顯著損害；藥物組與對照組比較，大鼠神經行為功能明顯改善（P＜0.05），見表2。

3 討論

在本實驗中我們發現大鼠腦缺血再灌注后缺血半暗帶區域SP免疫活性明顯增高，提示神經源性炎癥反應在腦缺血中起作用，通過使用神經激肽1受體拮抗劑抑制神經源性炎癥反應使損傷大鼠腦組織含水量有所減少，神經行為學功能得到改善，但腦梗死體積無明顯減小。

表2 3組大鼠缺血再灌注后轉棒試驗和肢體不對稱試驗結果的比較（%）

本實驗發現腦缺血再灌注24h后SP在腦組織缺血半暗帶區域活性明顯增高，在血管周圍尤其明顯。急性神經系統損傷中關于神經肽的報道較少，局限于周圍神經系統損傷、脊髓損傷、腦缺血及腦外傷等。Donkin等[4]證實創傷性腦損傷后神經源性炎癥的主要標志物SP在損傷組織周圍表達增多，并且與血腦屏障損害、腦水腫及神經功能損害顯著相關。Turner等[5]證實大鼠腦缺血再灌注24h時血管周圍組織、神經膠質組織、缺血半暗帶等區域SP免疫活性增加且其表達程度較梗死中心區明顯，而SP活性增加與腦水腫形成顯著相關，提示在腦梗死中神經源性炎癥與腦水腫相關。一項創傷性腦損傷人群試驗發現1周內死亡的患者經過神經病理學檢查證實患者皮質中微血管P物質免疫活性提高，血管周邊神經元損傷后產生局部神經肽釋放繼而血管通透性增加導致水腫[6]。另外在腦梗死、短暫性腦缺血發作及腦外傷人群中均有發現其血清SP水平增高的報道。也有研究證實腦組織SP活性增高但僅發生于可逆性缺血而非永久性缺血，提示再灌注損傷在引發神經源性炎癥反應的必要性[7]。

本實驗發現神經激肽1受體拮抗劑使腦缺血再灌注后24h腦組織含水量減少，證實了SP介導的神經源性炎癥反應和血管源性水腫在腦缺血后腦水腫形成中的作用。Donkin等[4]首次證實了神經激肽1受體拮抗劑可減輕大鼠創傷性腦損傷后血腦屏障通透性和腦水腫形成，并減輕神經功能損害。Turner等[8]證實在短暫性腦缺血再灌注試驗中神經激肽1受體拮抗劑減輕了再灌注24h時腦水腫程度。除了使用神經激肽1受體拮抗劑，有學者證實可利用神經肽清除的方法顯著減輕創傷后早期血腦通透性[9]，也推斷血管源性水腫是細胞毒性水腫的前提。因此我們猜想抑制神經源性炎癥反應可成為治療梗死后腦水腫的新途徑。

本實驗利用轉棒試驗及肢體不對稱試驗評估大鼠腦缺血后神經行為學，發現改善了腦缺血再灌注后神經功能損傷，但腦梗死體積無明顯減少，提示梗死體積并非決定腦梗死后神經功能的唯一因素，而神經突觸的可塑性與連接性對提高有效神經功能具有重要意義，神經激肽1受體拮抗劑是否有該作用有待進一步考證。

[1]Black P H．Stress and the inflammatory response:a review of neurogenic inflammation[J]．Brain Behav Immun,2002,16(6): 622-653．

[2]Severini C,Improta G,Falconieri-Erspamer G,et al．The tachykinin peptide family[J]．Pharmacol Rev,2002,54(2):285-322．

[3]Gartshore G,Patterson J,Macrae I M．Influence of ischemia and reperfusion on the course ofbrain tissue swelling and blood-brain barrier permeability in a rodent model of transient focal cerebral ischemia[J]．Exp Neurol,1997,147(2):353-360．

[4]Donkin J J,Nimmo A J,CernakI,et al．Acritical role for substance P in the development of traumatic brain edema[J]．J Cereb Blood Flow Metab,2009(8):1388-1398．

[5]Turner R J,Blumbergs P C,Sims N R,et al．Increased substance P immunoreactivity and oedema formation following reversible ischemic stroke[J]．ActaNeurochir,2006,Suppl,96:263-266．

[6]Zacest A C,Vink R,Manavis J,et al．Substance P immunoreactivity increases following human traumatic brain injury[J]．Acta Neurochir,2010,Suppl,106:211-216．

[7]Fu D,Ng Y K,Gan P,et al．Permanent occlusion of the middle cerebral artery upregulates expression of cytokines and neuronal nitric oxide synthase in the spinal cord and urinary bladder in the adult rat[J]．Neuroscience,2004,125(4):819-831．

[8]Turner R J,Vink R．Inhibition of neurogenic inflammation as a novel treatment for ischaemic stroke[J]．Drug NewsPerspect,2007, 20(4):221-226．

[9]Nimmo A J,Cernak I,Heath D L,et al．Neurogenic inflammation is associated with development of edema and functional deficits following traumatic brain injury in rats[J]．Neuropeptides,2004, 38(1):40-47．

Neuroprotective effects of neurokinin1 receptor antagonist on cerebral ischemia-reperfusion in rats

Objective To investigate the neuroprotective effects of neurokinin1 receptor antagonist on cerebral ischemia-reperfusion in rats．Methods Fifty four rats were randomly assigned to medication group,sham-operation group and control group with 18 animals in each group．Cerebral ischemia was induced using a reversible thread model of middle cerebral artery occlusion．The expression of substance P was observed by immunohistochemistry．Volume of brain infarction was calculated by TTC stain and edema formation was determined by wet weight-dry weight method．Neurological outcome was assessed using the rotarod test and asymmetry test．Results Immunohistochemistry revealed increase of SP following ischemia-reperfusion．Compared to control group the brain water content and neurological function impairment were attenuated in medication group, but the infarction volume was not reduced． Conclusion Neurokinin1 receptor antagonist may attenuate ischemia-reperfusion injury through inhibition of neurogenic inflammation．

Ischemia-reperfusion Substance P Brain edema Neurogenic inflammation

2012-02-21）

（本文編輯：楊麗）

杭州市醫藥衛生科技計劃項目2012B003

310006 杭州市第一人民醫院老年科

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