姜黃素抑制刺猬信號誘導小細胞肺癌細胞凋亡

劉杏娥

姜黃素抑制刺猬信號誘導小細胞肺癌細胞凋亡

劉杏娥

目的 探討姜黃素對小細胞肺癌NCI-H446細胞的作用及可能機制。方法 不同濃度（5、10、15μmol/L）的姜黃素作用于小細胞肺癌NCI-H446細胞后，采用MTT法檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞凋亡，Western blot技術檢測索尼克刺猬信號（Shh）、腦膠質瘤相關癌基因1（Gli1）的表達水平。結果 不同濃度的姜黃素與小細胞肺癌NCI-H446細胞共培養后，濃度為15μmol/L的姜黃素能明顯抑制NCI-H446細胞的增殖。與其余各組相比，差異有統計學意義（P＜0．01）。小細胞肺癌NCI-H446細胞經姜黃素處理后，姜黃素15μmol/L與其余各組比較，細胞凋亡率的差異有統計學意義（P＜0．01）。經姜黃素（15μmol/L）處理的NCI-H446細胞，Shh和Gli1表達均明顯降低，與對照組相比，差異均有統計學意義（P＜0．01）。結論 姜黃素能通過抑制刺猬信號通路，抑制小細胞肺癌細胞的增殖，誘導其凋亡。

姜黃素 小細胞肺癌 刺猬

姜黃素是一種從姜科植物姜黃中提取的酚化合物，具有強烈的抗炎、抗氧化、抗突變等特性。近年來的研究表明,姜黃素可通過多種機制抑制多種腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移，誘導其凋亡，并能提高其對化療藥物和放療的敏感性[1-2]。刺猬信號通路由刺猬配體、兩個跨膜蛋白受體patched（Ptch）、smoothened（Smo）以及下游轉錄因子Gli蛋白等組成。刺猬信號通路在胚胎發育、組織修復及癌癥發生等進程中發揮重要作用[3]。近年來研究發現，刺猬通路的異常激活與肺癌的發生、發展關系密切[4-5]。本文通過研究姜黃素對小細胞肺癌SCLC NCI-H446細胞體外增殖、細胞凋亡等影響，同時檢測索尼克刺猬信號（sonic hedgehog，Shh）、腦膠質瘤相關癌基因1（glioma associated oncogene 1，Gli1）蛋白表達水平，探討姜黃素對SCLC細胞的作用及可能的分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料 SCLC NCI-H446細胞購自中科院上海細胞所。姜黃素購自美國Sigma公司。兔抗人Shh、Gli1一抗購自美國Cell Signaling公司產品，鼠抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒購自聯科生物技術有限公司。DMEM、胎牛血清購自美國GIBCO公司。MTT購自美國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 姜黃素儲備液 稱取姜黃素368.38mg溶于無水乙醇40ml中，得姜黃素25mM保存。使用前取0.5ml儲備液加0.75mlDMEM培養液制成10mM工作液。

1.2.2 姜黃素抑制SCLC細胞增殖的實驗研究 采用MTT法檢測細胞增殖抑制率：NCI-H446細胞經DMEM常規培養，0.25%胰酶消化后,以1×104/ml接種于96孔培養板中，37℃過夜。將細胞分為姜黃素5、10、15μmol/L處理組及對照組，培養48h后將96孔板中的細胞以500g離心3min，棄100μl上清液，加MTT 10μl（5mg/ml），37℃孵育4h，加DMSO 100μl，震蕩10min后上酶標免疫測定儀檢測OD490值。計算細胞增殖抑制率，抑制率=（1-處理組A值/對照組A值）×100%。

1.2.3 姜黃素誘導SCLC細胞凋亡的實驗研究 采用Annexin V-FITC/PI雙染色法，按試劑盒說明書操作：NCI-H446細胞經DMEM常規培養后用0.25%胰酶消化，以1×105/ml接種于6孔培養板中培養過夜，將細胞分姜黃素5、10、15μmol/L處理組及對照組。經48h處理后胰酶消化收集細胞，800g離心5min，再經PBS洗3次，分別加緩沖液50μl、V-FITC 5μl、PI 10μl，避光5min以上，進行流式細胞檢測。

1.2.4 姜黃素對Shh、Gli1表達的影響 采用Western blot技術檢測Shh、Gli1的表達水平：NCI-H446細胞經DMEM常規培養后用0.25%胰酶消化,以1×105/ml接種于6孔培養板中培養過夜，將細胞分為姜黃素15μmol/L處理組及對照組，48h后收集各組細胞，一步法裂解細胞后以13 000r/min高速離心10min，取上清液進行蛋白定量。常規制備10%SDS-PAGE分離膠和積層膠。每孔上樣蛋白量50μg，加4×上樣緩沖液，混勻后煮沸5min，上樣后100V電泳至染料跑出膠。輕輕取下膠，用Millipore H2O洗膠1次，100V轉膜2h，用封閉液37℃封閉2h，加入相應的一抗（1∶1 000）4℃過夜，TBST洗膜4次，10min/次，加辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5 000）室溫1h，TBST洗膜4次，10min/次，最后加ECL液曝光顯色。結果用Band Leader軟件進行條帶灰度半定量分析。1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 MTT增殖試驗 姜黃素5、10、15μmol/L處理組的NCI-H446細胞增殖抑制率為（14.61±2.94）%、（17.24± 2.91）%、（58.34±4.91）%。隨著姜黃素濃度的逐漸增加，NCI-H446細胞的增殖抑制率也逐漸增加，姜黃素5、10μmol/L處理組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），與對照組比較，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；而姜黃素15μmol/L處理組與姜黃素5、10μmol/L和對照組比較，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。

2.2 細胞凋亡檢測 姜黃素5、10、15μmol/L處理組的NCI-H446細胞凋亡率分別為（3.29±0.26）%、（3.86± 0.33）%及（27.31±1.42）%，對照組為（2.80±0.31）%（圖1）。姜黃素15μmol/L處理組較5、10μmol/L處理組及對照組明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.3 姜黃素抑制NCI-H446細胞Shh、Gli1的表達 見圖2、3。

圖3 姜黃素15μmol/L處理組、對照組Shh、Gli1的半定量比值對比圖（1：姜黃素15μmol/L處理組；2：對照組）

由圖3可見，在姜黃素15μmol/L處理組Shh、Gli1蛋白表達水平均較對照組明顯降低，差異均有統計學意義（t=7.44、5.94，均P=0.000）。

3 討論

SCLC是肺癌的一個未分化癌分型，在肺癌中所占的比例約15%～20%，SCLC分為局限期和廣泛期，大多數SCLC診斷時已為廣泛期，局限期最多占1/3。小細胞肺癌的細胞倍增時間短，進展快，常伴內分泌異常或類癌綜合征，早期即發生血行轉移，可手術的患者僅占全部患者的5%，故SCLC的治療以全身化療為主。盡管新藥不斷涌現，但并沒有明顯改善SCLC的預后。靶向治療近年來不斷地改寫NSCLC的臨床治療策略，但令人失望的是SCLC的靶向治療至今尚無突破。

姜黃素刺猬信號通路是一條高度保守的信號傳導通路，主要由信號分子刺猬、Ptch、Smo和下游的核轉錄因子Gli組成。Gli的靶基因涉及到腫瘤細胞的生長、凋亡、轉移、上皮間質轉化、新生血管形成等多個方面[6]。近年來的研究表明，刺猬或Gli信號通路在SCLC中常持續異常活化，在SCLC的發生、發展過程中起重要作用[7]。

姜黃素因具有預防腫瘤、抑制腫瘤、放化療增敏等多種作用，近年來在腫瘤領域受到極大關注。研究表明，姜黃素對多種腫瘤細胞，包括乳腺癌、胃癌、大腸癌、肺癌、胰腺癌等均具有化學預防及治療作用[8-9]。姜黃素抗腫瘤作用的機制主要是通過調節多條信號通路分子，如下調EGFR、HER-2、Wnt/β-catenin及其下游信號分子ERK、AKT、NF-κB、STATs等，上調p21、p27、細胞周期激酶抑制劑等[10-13]。

我們研究了姜黃素對SCLC細胞NCI-H446的增殖抑制及誘導凋亡作用。結果發現，不同濃度的姜黃素與SCLC細胞NCI-H446共培養后，隨著姜黃素濃度的逐漸增加，NCI-H446細胞的增殖抑制也逐漸增加，濃度為15μmol/L的姜黃素可明顯抑制NCI-H446細胞的增殖。NCI-H446細胞經姜黃素處理后，細胞凋亡率明顯高于對照組。這提示姜黃素可在體外誘導NCI-H446細胞凋亡，抑制細胞增殖。本研究發現，經姜黃素處理后，NCI-H446細胞Shh和Gli1的表達水平明顯下降。Gli蛋白是Smo下游的轉錄因子，在刺猬通路中起關鍵作用。Gli1也是刺猬信號活化后的靶基因，Gli1表達下降，提示刺猬信號通路被抑制。

本研究結果提示，姜黃素能抑制SCLC細胞NCIH446的體外增殖，并可能通過抑制細胞刺猬信號通路的信號分子Shh、Gli1表達誘導NCI-H446細胞的凋亡。姜黃素作用48h后，NCI-H446細胞中的Shh、Gli1蛋白表達水平均降低，這些結果提示姜黃素可抑制刺猬信號分子的活化。

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Curcumin induces apoptosis of small cell lung cancer cells by inhibiting Hedgehog signaling pathway

Objective To investigate the effects of curcumin on small cell lung cancer cells and the possible molecular mechanisms．Methods The cultured small cell lung cancer NCI-H446 cells were treated with concentrations of curcumin,the cell proliferation was measured by MTT assay,apoptosis was detected by flow cytometery,the expressive level of Shh and GLI1 were detected by Western blot．Results Curcumin(15μmol/L)significantly inhibited the growth of NCI-H446 cells(P＜0．01)and induced cell apoptosis(P＜0．01)．The expressive levels of Shh and GLI1 in curcumin treated groups were significantly reduced compared to those in control group(P＜0．01)．Conclusion Curcumin can inhibit proliferation and induce apoptosis of small cell lung cancer cells by inhibiting Hedgehog signaling pathways．

Curcumin Small cell lung cancer Hedgehog

2012-08-27）

（本文編輯：楊麗）

310013 杭州，浙江醫院腫瘤科