原因不明性復發性流產淋巴細胞免疫治療的劑量及療效研究

王海燕 吳曉云 李曉榮 魏麗娜 邱惠麒 朱國戰 周媛萍

原因不明性復發性流產淋巴細胞免疫治療的劑量及療效研究

王海燕 吳曉云 李曉榮 魏麗娜 邱惠麒 朱國戰 周媛萍

目的 探討原因不明性復發性流產（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）患者再次妊娠結局及治療前后患者外周血調節性T細胞水平的變化。方法 對165例URSA患者進行主動免疫治療，觀察患者治療后再次妊娠結局。同時檢測和分析治療前后患者外周血的CD4+CD25+Tr水平。將試驗過程中供體血漿析出較少致使分離得到的淋巴細胞較少的患者37例作為低劑量組，較多者84例作為高劑量組。結果 165例患者中，再次妊娠121例，仍在治療中44例。再次妊娠的患者中成功分娩87例，再次發生早期流產14例，繼續妊娠20例，主動免疫治療成功率88．5%。其中低劑量組成功分娩29例，再次早期流產8例，主動免疫治療成功率（72．4%）顯著低于高劑量組（92．3%），差異有統計學意義（P＜0．05）。所有患者治療后CD4+CD25brightT表達水平均顯著高于治療前（P＜0．05）；妊娠成功患者外周血CD4+CD25+Tr及CD4+CD25brightT均較妊娠失敗者顯著升高（P＜0．05）。 結論 主動免疫治療對URSA患者有效，治療時應注射高劑量淋巴細胞，主動免疫治療可顯著提高患者CD4+CD25brightT的表達水平，CD4+CD25brightT可能是調控母胎界面局部免疫耐受形成的一個重要因素。

原因不明性復發性流產 CD4+CD25+T細胞 淋巴細胞免疫治療

復發性流產（recurrent spontaneous abortion，RSA）系指2次及2次以上的自然流產。RSA的流產多發生于同一妊娠月份，是婦產科常見病。RSA的病因復雜，除了遺傳、內分泌、解剖、微生物感染等傳統病因外，仍有很多病因未明確。原因未明的稱之為原因不明性復發性流產（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）。近代生殖免疫的研究認為，妊娠是一種半同種移植現象，妊娠成功依賴于母胎之間的免疫耐受關系。URSA多系同種免疫異常，導致母胎免疫耐受關系被打破，而CD4+CD25+Tr對免疫耐受具有調節作用，可能在母胎免疫耐受中起著重要的作用，其平衡的失調可能會影響妊娠結局[1]。目前國內外通常采用患者配偶或第三方淋巴細胞對URSA患者進行主動免疫治療。本文探討對URSA患者進行主動免疫治療的效果及CD4+CD25+Tr細胞與URSA的關系。

1 對象和方法

1.1 對象 2008-03—2011-03我院生殖中心收治的確診為URSA患者165例，年齡24～38（30.5±3.5）歲。所有患者均具備以下條件：（1）流產次數≈2次，均為早期流產（孕周＜12周）；（2）夫妻染色體檢查正常；內分泌檢查、TORCH檢查均正常，無生殖道畸形、母兒血型不和因素；免疫各項檢查如抗心磷脂抗體、抗核抗體及封閉抗體均陰性；（3）配偶男科相應檢查均正常。

1.2 方法

1.2.1 主動免疫治療 抽取患者配偶或第三方個體靜脈血20ml（肝炎病毒學、梅毒抗體、艾滋病抗體均正常）2%肝素抗凝取血漿，置入預先加有淋巴細胞分離液的離心管中（淋巴細胞分離液比重1.020，法國Biowest公司生產），注意淋巴細胞分離液和血漿之間界面保持清晰。以250g/min離心15min，取淋巴細胞層，磷酸鹽緩沖液洗滌2次后用0.9%氯化鈉溶液制成淋巴細胞懸液，取0.5～0.8ml懸液于患者雙側前臂各分4～6點皮內注射。治療間隔3～4周，3次為1個療程，治療期間注意避孕，于1個療程結束后鼓勵患者在6個月內妊娠，6個月后若未懷孕再進行下1個療程治療。如獲妊娠則每4周加強免疫1次至12～20周，隨訪至分娩。主動免疫治療前和第1個療程結束后2周、臨床妊娠成功后（孕周＞12周）以及再次早期流產后分別抽取患者外周血2ml進行流式細胞檢測。將試驗過程中供體血漿析出較少致使分離得到的淋巴細胞較少的患者37例作為低劑量組，將供體血漿析出較多，從而分離得到的淋巴細胞亦較多的患者84例作為高劑量組。

1.2.2 流式細胞術檢測調節性T細胞 采用Ficoll法分離出外周血單個核細胞，將收集的淋巴細胞濃度調整至（10～20）×106/ml；取100μl放入流式管，加入CD4-FITC（Cat Num 555432）、CD25-PE（CatNum 555346）抗體各5μl；再取100μl放入另一流式管，加入FITC-IgG（CatNum 555432）和PE-IgG（Cat Num 555346）各5μl作為陰性對照，最后上機檢測（以上試劑均為美國BD PharMingen公司生產）。

1.3 統計學處理 采用SPSS16.0統計軟件，計量資料以表示，治療前后及組間比較采用t檢驗。計數資料以頻數與百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 主動免疫治療后的再次妊娠結局 165例患者中，再次妊娠121例，仍在治療中44例。再次妊娠的121例患者中成功分娩87例，繼續妊娠20例，再次發生早期流產14例，主動免疫治療成功率達88.5%（107/121）。

2.2 治療前后患者外周血調節性T細胞水平變化 見表1。

表1 治療前后URSA患者外周血CD4+CD25+Tr表達水平比較（%）

由表1可見，主動免疫治療后患者外周血CD4+CD25brightT表達頻率較治療前顯著升高，CD4+CD25dimT表達頻率治療前后無明顯變化。

2.3 不同劑量的淋巴細胞對URSA患者治療效果 低劑量的淋巴細胞主動免疫治療URSA患者妊娠成功29例，妊娠失敗8例，再次妊娠成功率為72.4%（29/37），顯著低于高劑量組妊娠率92.3%（78/84），差異有統計學意義（χ2=5.26，P＜0.05）。

2.4 治療后不同妊娠結局的URSA患者外周血CD4+CD25+Tr表達水平比較 見表2。

表2 治療后不同妊娠結局的URSA患者外周血CD4+CD25+Tr表達水平比較（%）

3 討論

現代生殖免疫學認為妊娠是一種半同種移植過程，妊娠成功維系依賴于母胎之間所呈現出的免疫耐受狀態。正常的妊娠過程涉及到諸多因素之間的平衡，其中任何一個環節出現異常，都有可能打破機體的免疫耐受，導致妊娠失敗[2]。

近年來研究發現，CD4+CD25+Tr是機體以主動的方式獲得和維持自身耐受的一種重要方式。人類的CD4+CD25+Tr可分為CD4+CD25brightT和CD4+CD25dimT兩個細胞亞群[3]，其中CD4+CD25brightT主要表現免疫抑制和免疫無能兩個主要特性，CD4+CD25dimT與機體的免疫耐受無關。

已有眾多報道表明URSA患者外周血和蛻膜組織中Tr數量和功能明顯低于正常妊娠婦女，使得母體對胎兒免疫抑制作用減弱，胚胎遭受免疫攻擊而發生流產[4-5]。目前國內外通常采用配偶或第三方淋巴細胞對URSA患者進行主動免疫治療，其目的是誘導妊娠母體對胎兒的免疫耐受，避免母體免疫系統對胎兒的攻擊，從而使得妊娠過程得以順利進行。楊卉等[8-9]發現URSA患者正常早孕婦女外周血CD4+CD25+Tr均顯著高于正常未孕婦女；治療后 URSA患者的 CD4+CD25brightT表達水平顯著高于治療前；妊娠成功患者外周血CD4+CD25+Tr及CD4+CD25brightT均較妊娠失敗者顯著升高，認為CD4+CD25+Tr參與了正常妊娠的維持，有可能是調控母胎界面局部免疫耐受形成的一個重要因素，對維持妊娠至關重要。這與本次研究結果基本一致，我們發現對URSA患者行主動免疫治療，再次妊娠成功率達88.5%，效果明顯，這與國內外報道的65%～95%的成功率一致。表明主動免疫治療URSA是安全有效的，其可以提高CD4+CD25+Tr的表達水平，從而維持妊娠母胎之間的免疫耐受。同時本研究發現高劑量淋巴細胞主動免疫治療效果要優于低劑量，可能低劑量不足以激發母體的免疫耐受，在臨床上應采取高劑量的治療方案。

目前對CD4+CD25+Tr免疫調節效應的確切機制尚存爭議，主要有以下觀點：一是通過細胞與細胞間的直接或間接接觸改變T細胞的表型和功能，如抑制自身反應性T細胞的免疫反應、抑制傳統T細胞的活化等廣泛參與免疫耐受調節，維持機體內環境的穩定[10]；另一種是通過分泌多種細胞因子主要是IL-10、TGF-β等免疫抑制因子，間接參與機體的免疫調節[11]。產生這一差異的原因可能與CD4+CD25+Tr作用于不同的細胞，或與其發揮不同的效應時所依賴的機制不同有關[12]。

綜上所述，本文通過對主動免疫治療URSA效果以及治療前后CD4+CD25+Tr水平變化的觀察提示，主動免疫治療URSA是安全有效的，CD4+CD25+Tr在治療前后有顯著升高，其可能是調控母胎界面局部免疫耐受形成的一個重要因素，有可能成為免疫治療效果的監測指標。CD4+CD25+Tr作用的具體機制目前仍有爭議，將是未來研究的的重點。

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Efficacy of immunotherapy with different doses for unexplained recurrent spontaneous abortion

Objective To assess the efficacy of lymphocyte therapy with different doses for unexplained recurrent spontaneous abortion(URSA)．Methods One hundred and sixty five women with URSA received lymphocyte therapy with different doses．The outcomes of pregnancy were documented and the percentage of CD4+CD25+Tr in peripheral blood was measured by flow cytometry before and after lymphocyte therapy．Results Among 165 patients re-pregnancy was obtained in 121 cases,in whom 87 cases were successfully delivered,14 cases had early abortion and 20 cases were still under pregnancy with a success rate of 88．5%．Thirty seven cases with low dose treatment all obtained re-pregnancy,including 29 cases of successful delivery and 8 cases of early abortion with a success rate of 72．4%,which was significantly lower than that of high dose group(92．3%,P＜0．05)．After treatment the level of CD4+CD25brightT was significantly(P＜0．05)higher than before treatment．The CD4+CD25+Tr and CD4+CD25brightT levels in patients with successful pregnancy were significantly higher than those with failed pregnancy (P＜0．05）．Conclusion Lymphocyte therapy is effective for URSA women,particularly with high dose lymphocytes,which is associated with increased CD4+CD25brightT and CD4+CD25brightTr levels in peripheral blood．

URSA CD4+CD25+TrLymphocyte therapy

2012-10-26）

（本文編輯：楊麗）

湖州市科技計劃項目（2010YS11）

313000 湖州市婦幼保健院生殖中心

王海燕，E-mail：whylzg1717@163.com