維生素D受體基因BsmI位點多態性與橋本甲狀腺炎的關系

余曉軍 藍小春

維生素D受體基因BsmI位點多態性與橋本甲狀腺炎的關系

余曉軍 藍小春

隨著人們對維生素D認識的不斷加深，現已發現維生素D不但參與鈣磷代謝的調節，而且參與細胞免疫的調節。研究已證實活性維生素D[1，25（OH）2D3]與眾多的自身免疫性疾病發病相關，其可以阻止實驗性橋本甲狀腺炎（HT）等自身免疫性甲狀腺疾病的發生[1]，其生物學作用是通過維生素D受體蛋白（VDR）所介導的。本研究將VDR基因作為候選基因，探討VDR基因BsmI位點多態性與HT的關系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇2009-11—2011-11在蘭溪市人民醫院內分泌門診就診的初發HT患者75例（HT組），其中男20例，女55例，年齡20～47（36.31±14.25）歲。根據臨床癥狀、體征、甲狀腺功能（FT3、FT4、TT3、TT4、TSH）測定結果、甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）和甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）強陽性以及甲狀腺細針穿刺活檢結果（涂片可見較多淋巴細胞或有濾泡細胞嗜酸變者）等確診，排除其他原因引起的甲狀腺功能亢進、甲狀腺功能減退以及合并其他自身免疫性疾病的患者。另選擇健康體檢者80例為對照組（CN組），其中男30例，女60例，年齡26～50（39.15±4.21）歲，均為同時期無血緣關系的健康體檢者，無甲狀腺疾病及其他自身免疫性疾病的臨床表現、相關既往史及家族史。兩組性別、年齡差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 取枸櫞酸二鈉（EDTA）抗凝血50μl，用堿裂解法提取外周血白細胞DNA。

1.2.2 聚合酶鏈式反應（PCR）：反應引物由上海生物工程技術有限公司合成，引物序列：上游5′GGG AGA CGT AGC AAA AGG 3′；下游5′AGA GGT CAA GGG TCA CTG 3′。PCR反應體系（25μl）：10×PCR緩沖液2.5μl，MgCl22.5μl，dNTP（10mM）0.5μl，上下游引物（10μM）各1.25μl，TaqDNA聚合酶1U，模板DNA3μl，純水13.9μl。PCR反應條件：預變性94°C 3min，變性94°C 40s，退火62°C 50s，延伸72°C 60s，共30個循環，最后終末延伸72°C 5min。擴增產物為359bp，于1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 限制性片段長度多態性分析（RFLP） PCR產物經BsmI限制性核酸內切酶酶切后，置于2%的瓊脂糖凝膠電泳確定基因型。BB型為不含BsmI酶切位點，即酶切后只有一個359bp的片段；bb型為兩條染色體均有酶切位點，酶切后有兩個片段，即169bp、190bp；Bb型為雜合型只有一條染色體含酶切位點，酶切后有3個片段，即359bp、169bp、190bp。所有試劑均購自上海生物工程技術有限公司。

1.3 統計學處理 采用SPSS11.0統計軟件，各組間基因型、等位基因頻率分布采用χ2檢驗。

2 結果

兩組VDR-BsmI基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，證實本實驗樣本具有群體代表性。VDRBsmI基因型、等位基因分布頻率的比較 見表1。

表1 VDR-BsmI基因型、等位基因分布頻率比較[例（%）]

由表1可見，HT組與CN組間的VDR-BsmI基因型、等位基因分布頻率比較差異均無統計學意義（χ2= 1.685、2.189，均P＞0.05）。

3 討論

HT是一種器官特異性的自身免疫疾病，其發生、發展是遺傳、免疫及環境因素共同作用的結果。研究認為免疫調節網絡失衡（Th1/Th2平衡偏移）是HT發病的關鍵環節：Th1/Th2平衡遭到破壞，Th1型細胞因子（IL-2、IFN一γ、IL-12、TNF-α和TNF-β）的分泌占主導地位，這類細胞因子可通過改變免疫活性細胞的某些功能狀態直接或間接參與HT的發生[2-3]。同時這些細胞因子的基因多態性也與HT的發生密切相關[4]。

1，25（OH）2D3是一種重要的免疫調節劑，尤其針對T細胞介導的細胞免疫。其主要作用靶細胞是Th1細胞，它可通過直接抑制Th1細胞從而達到下調Th1、上調Th2細胞的作用。調節Th1/Th2比例失衡引發的免疫紊亂[5]。其生物學功能主要通過VDR介導。VDR基因位于常染色體12q13-14,其基因組DNA全長45kd，由9個外顯子和8個內含子組成,存在多個多態性位點最常見的為：3'端的BsmI、ApaI、TaqI和5′端的FokI。這些區域的堿基的變化都會影響VDR基因的轉錄及VDR蛋白合成與活性，從而影響1，25（OH）2D3發揮其免疫調節作用引致自身免疫性疾病的發生[6]。

目前關于VDR基因與HT相關性的研究鮮有報道，臺灣地區的一項研究認為VDR基因多態性與HT的發病相關,HT患者與正常人群間VDR的單核苷酸多態性（SNP）分布的差異具有統計學意義（P=0.0458）；且VDRFokI基因是HT發病的易感因素[7]。本研究通過檢測HT患者以及健康人群的VDR基因BsmI位點后發現兩組間VDR-BsmI基因型及等位基因頻率差異無統計學意義，因此認為VDR基因BsmI位點多態性與HT發病無關，VDR-BsmI基因型不能作為預測發生HT的遺傳標志。

總之，VDR基因不僅存在種族、地區的差異性，同時還存在多個多態性位點，不同位點的多態性以及與臨近位點的基因協調作用也可能會影響HT的發生。因此對于VDR基因其他位點多態性是否與HT發病相關還有待于進一步研究證實。

[1]Fournier C,Gepner P,Sadouk M,et al．In vivo beneficial effects of cyclosporin A and 1,25-dihydroxyvitamin D3 on the induction of experimental autoimmune thyroiditis[J]．Clin immunol Immunopathol,1990,54(1):53-63．

[2]Roura-Mir C,Catalfamo M,Sospedra M,et al．Single-cell analysis of intrathyroidal lymphocytes shows differential cytokine expression in Hashimoto's and Grave's disease[J]．Eur J Immunol,1997, 27(12):3290-3320．

[3]Mazziotti G,Sorvillo F,Naclerio C,et al．Type-1 response in peripheral CD4+and CD8+T cells from patient with Hashimoto's thyroiditis[J]．Eur J Endocrinol,2003,148(4):383-388．

[4]Hunt P J,Marshal S E,Weetman A P,et al．Cytokine gene polymorphismsin autoimmune thyroid disease[J]．JClinEndocrinol Metab,2000,85(5):1984-1988．

[5]Meehan T F,DeLuca H F．The vitamin D receptor is necessary for 1alpha,25-dihydroxyvitamin D (3)to suppress experimental autoimmune encephalomyelitis in mice[J]．Arch Biochem Biophys, 2002,408(2):200-220．

[6]Farrows S．Allelic variation and the vitamin D receptor[J]．Lancet, 1994,343(8908):1242．

[7]Lin W Y,Wan L,Tsai C H,et al．Vitamin D receptor gene polymorphisms are associated with risk of Hashimoto's thyroiditis in Chinese patients in Taiwan[J]．Journal of Clinical Laboratory Analysis．2006,20(3):109-112．

2012-12-20）

（本文編輯：楊麗）

321100 蘭溪市醫學科學研究所（余曉軍），蘭溪市人民醫院內分泌科（藍小春）