快速檢測志賀毒素2基因的LAMP方法的建立

張雪寒， 何孔旺， 葉 青， 李 彬， 倪艷秀， 溫立斌， 王小敏， 周俊明

(江蘇省農業科學院獸醫研究所，農業部獸用生物制品工程技術重點實驗室，國家獸用生物制品工程技術研究中心，江蘇 南京210014)

志賀毒素(Shiga toxin，Stx)又稱Vero毒素，是產志賀毒素大腸桿菌(Shiga toxin-producing E.coli，STEC)重要毒力因子之一，具有細胞毒性、腸毒性、神經毒性作用，是導致被感染者出現嚴重癥狀甚至死亡的主要原因，因此，有必要建立敏感而快速的檢測Stx方法。細菌培養方法需要耗費3 d，而快速檢測方法如ELISA需要高濃度的病原菌才能檢測到［1-2］。PCR也是一種快速的檢測方法，但是一般需要增菌才能檢測到低濃度的病原菌，并且依賴于電泳，耗費幾個小時。近年來，定量PCR被應用于食源性病原的檢測，敏感性高，但需要專用儀器設備，定量PCR儀價格昂貴［3］。

環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種可對核酸進行高效擴增并廣泛應用于病原快速檢測的一種新型檢測方法，日本學者Notomi等［4］發明了環介導等溫擴增反應，其特點是針對靶基因設計2～3對特異引物(內引物、外引物和環引物，其中環引物為非必要引物)，在Bst DNA polymerase等溫條件下作用幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應。已有學者將該技術運用到大腸桿菌志賀毒素的檢測中［5-6］，但一般使用 SYBR Green染料。SYBR Green特異性較差，PCR中只要有擴增反應，即產生綠色熒光，因此很容易出現非特異性的熒光，影響結果判斷。本研究擬使用鈣黃綠素作為發光劑，只有在發生LAMP反應時才會產生綠色熒光，較少出現非特異熒光。

1 材料與方法

1.1 菌株及樣品

大腸桿菌O157∶H7 8624(揚州大學朱國強教授惠贈)及其臨床分離株 10個;大腸桿菌 K88、K99、O139、O26、O55以及腸炎沙門氏菌為本實驗室保存。另外還有牛糞、豬糞、蔬菜和水果樣品各10份。

1.2 主要試劑與儀器

dNTP(TaKaRa 公司);Bst酶、甜菜堿、Mg2SO4、MnCl2等化學試劑(南京助研生物技術有限公司產品);鈣黃綠素(北京藍譜有限公司產品);凝膠電泳儀及成像儀(上海培清公司產品);恒溫水浴箱(嘉興市中新醫療儀器有限公司產品);WH-2微型渦漩混合儀(上海滬西分析儀器廠產品);Dynabeads anti-E.coli O157免疫磁珠(挪威DYNAL公司產品);2×Taq PCR MasterMix［天根生化科技(北京)有限公司產品］。

1.3 引物

參照GenBank中多個Stx2序列，利用在線生物軟件Primer explorer V4設計 LAMP引物。F3:5'-CAGTTATACCACTCTGCAACGTG-3';B3:5'-CTGATTCGCCGCCAGTTC-3';FIP:5'-GCTCTTGATGCATCTCTGGTACACTCACTGGTTTCATCATATCTGG-3';BIP:5'-CTGTCACAGCAGAAGCCTTACGGACGAAATTCTCCCTGTATCTGCC-3'。引物由TaKaRa有限公司合成。

1.4 菌株培養

所有細菌用營養瓊脂平板和營養肉湯傳代和增菌。

1.5 DNA 的提取

取1 ml菌液，12 000 r/min離心2 min，棄上清，加入100 μl TE懸浮沉淀，沸水浴10 min，冷卻至室溫，12 000 r/min離心8 min，取上清作為PCR擴增模板。

1.6 LAMP檢測方法的建立

分別優化引物濃度、Mg2+濃度、dNTP濃度、反應溫度、反應時間，建立LAMP檢測體系。LAMP檢測體系為:1×Buffer［Tris-HCl 20 mmol/L，Mg2+8 mmol/L，0.1%Tween-20，KCl 10 mmol/L，(NH4)2SO410 mmol/L，dNTPs 1.4 mmol/L，甜菜堿 1 mol/L］12.5 μl，內引物 50 μmol/L和外引物 5 μmol/L各 1.0 μl，Bst DNA 聚合酶 8 U，DNA 2.0 μl，補水至25.0 μl。反應條件為65℃ 50 min，80℃加熱3 min后，加入熒光染料，肉眼觀察結果。1.2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴增產物。

1.7 特異性試驗

對腸炎沙門氏桿菌及大腸桿菌O139、K88、K99、O26和O55細菌基因組核酸，按照所建立的LAMP和PCR方法進行特異性試驗。

1.8 敏感度試驗

將大腸桿菌O157∶H7過夜培養物平板計數，定量為1×1010CFU/ml，采用煮沸方法制備模板。將模板10倍系列稀釋至10－10，用所建立的LAMP和PCR方法分別檢測大腸桿菌O157∶H7。

1.9 田間應用驗證

1.9.1 模擬樣品的檢測 將大腸桿菌O157∶H7過夜培養物從 10－6至 10－8稀釋，濃度分別為 104CFU/ml、103CFU/ml和102CFU/ml。分別將0.1 ml稀釋培養物接種到10 g新鮮生牛肉中，制備含有不同濃度病菌的生牛肉樣品。用所建立的LAMP和PCR方法分別檢測大腸桿菌O157∶H7。

1.9.2 田間采集樣品的檢測 牛糞樣品、豬糞樣品、蔬菜樣品和牛肉樣品各10份，用LAMP、PCR和免疫磁珠試劑盒分別檢測細菌。LAMP和PCR參照方法1.6，免疫磁珠分離參照Dynabeads anti-E.coli O157免疫磁珠試劑盒說明書。

2 結果

2.1 LAMP擴增結果

LAMP擴增結束后，加入熒光染料，陽性管能夠看到明顯的綠色熒光，而陰性管為橙色;瓊脂糖電泳能夠看到清晰的擴增條帶。

2.2 LAMP特異性試驗

大腸桿菌O157∶H7、O139和O26基因組能夠擴增出stx2相應大小條帶，相應的反應管變為綠色，其他為陰性。

2.3 LAMP敏感性試驗

LAMP檢測大腸桿菌O157∶H7純菌的敏感性可以達到1 CFU/ml，而PCR為 10 CFU/ml。對模擬的O157∶H7陽性樣品檢測的敏感性可以達到10 CFU/ml，而PCR為103CFU/ml。

2.4 LAMP檢測方法驗證

牛糞、豬糞、蔬菜和牛肉各10份的LAMP檢測結果，2份牛糞和1份荸薺為陽性，其余為陰性;PCR檢測結果，1份牛糞和1份荸薺為陽性，其余為陰性;免疫磁珠分離檢測結果，2份牛糞和1份荸薺為陽性，其余為陰性。

3 討論

STEC是時常引發食源性腹瀉的重要病原菌之一［7］。STEC可以產生兩種毒素，分別為志賀毒素1(Stx1)和志賀毒素2(Stx2)，是引發出血性腸炎(Hemorrhagic enteritis，HC)和溶血尿毒綜合征(Hemolytic uremic syndrome，HUS)的主要元兇［8］。攜帶Stx2的STECO數量明顯高于Stx1，并且Stx2能夠分泌到菌體外，有著更嚴重的致病作用［9-10］。Stx2有多個變型:Stx2c、Stx2d、Stx2e、Stx2f和 Stx2v，與菌株血清型和致病性有著密切關系［11］。盡管STEC包括很多的血清型，但目前O157∶H7仍然是最重要的致病血清型，它產生和分泌的Stx2對人的致病力最強［8］。本研究對傳統LAMP進行改進，LAMP擴增所需液體預先配制成預混液，擴增結束后加入鈣黃綠素顯色觀察。

為了研究 LAMP的敏感性，選用1×1010CFU/ml的O157∶H7純培養物和接種后的牛肉樣品分別進行檢測。對模擬制備的牛肉樣品檢測敏感性略低于純培養物，可能牛肉的雜質影響了擴增效果，但LAMP的敏感性(10 CFU/ml)還是遠遠高于普通PCR(103CFU/ml)。

為研究LAMP的特異性，選用大腸桿菌O157∶H7分離株、豬水腫病代表血清型O139、腸致病性代表血清型O26和O55以及沙門氏桿菌作為參照。PCR和LAMP檢測結果一致:沙門氏桿菌和腸致病性大腸桿菌O55未擴增出任何條帶，顯色反應陰性;O139和O26能夠擴增出目的條帶，并且顯色反應陽性。豬水腫病大腸桿菌O139分泌志賀毒素2的變異體Stx2e，能夠被LAMP所擴增，說明本試驗設計的引物適用所有stx2基因，且LAMP特異性良好，不受菌株血清型差異的影響。

為了檢驗LAMP的實用性，采集不同來源的多份臨床樣品進行檢測，同時進行PCR擴增和免疫磁珠分離。免疫磁珠分離結果與LAMP一致，但其操作繁瑣，分離后同樣需要進一步的PCR鑒定，而LAMP操作方便快捷。PCR在臨床樣品檢測中，需要增菌后才能夠達到較好的敏感性。在采集的多種樣品中，糞便中病菌檢出率高于其他樣品，與先前報道一致［12］，但糞便樣品干擾成分較多，PCR方法檢測時，重復性和檢出率較低;而利用LAMP擴增時，與檢測其他樣品效果無明顯差異。

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