陸地棉GhNIP5.1基因的電子克隆及生物信息學分析

鞏元勇， 郭書巧， 束紅梅， 何林池， 倪萬潮

(1.江蘇省農業科學院經濟作物研究所，農業部長江下游棉花和油菜重點實驗室，江蘇 南京 210014;2.江蘇沿江地區農業科學研究所，江蘇 如皋 226541)

水通道蛋白(Aquaporin，AQP)是古老的通道蛋白MIP(Membrane intrinsic protein)家族成員之一，是廣泛存在于動植物和微生物中，負責轉運水分子和某些小分子物質的一類膜嵌入式蛋白。1992年，第一個植物水通道蛋白從擬南芥中分離獲得，由于其定位在液泡膜，因此被命名為液泡膜內在蛋白(TIP)［1］。近年來，在玉米、棉花、水稻、油菜、向日葵等多種植物中都發現有AQPs的存在，且在植物不同發育時期的不同組織和器官中廣泛分布［2］。與其他類型的生物相比，植物AQPs類型更為豐富，多樣性也更大［3］。根據植物體AQPs的結構和細胞定位的不同分為4種類型，液泡膜內在蛋白、質膜內在蛋白(PIP)、大豆根廇菌周膜上水通道蛋白類NOD26膜內在蛋白(NIP)以及定位于內質網和質膜上的小分子堿性膜內在蛋白(SIP)［4-6］。植物AQPs不僅具有水分子運輸功能，還具有某些營養元素(硅、硼等)［5-7］和某些中性小分子(甘油、尿素、甲酰胺等)［8］的運輸功能，在植物細胞水分平衡的維持和生長發育等生理過程中具有舉足輕重的作用。

利用生物信息學同源性搜索和分子克隆，在陸地棉(Gossypium hirsutum)中發現存在71 個 AQPs［9］。但是絕大多數的棉花AQPs還沒有克隆獲得全長序列，對它們的生理及分子功能的理解更是遠遠不夠。本試驗通過電子克隆的方法，獲得棉花GhNIP5.1基因全長的開放閱讀框序列，并在棉花基因組測序結果中，搜索獲得了GhNIP5.1基因的編碼區序列，對所獲得的序列進行了一系列的生物信息學的預測和分析，以期為進一步深入研究該基因的功能提供必要的基礎。

1 材料與方法

1.1 棉花GhNIP5.1基因的電子克隆

根據同源基因中存在保守序列的特性，用擬南芥AtNIP5.1基因(NCBI登錄號:NM_117106)序列為信息探針，對NCBI中EST數據庫棉花(Gossypium hirsutum)進行Tblastx同源性檢索，將檢索到的來自于棉花的EST序列利用DNAS-tar軟件拼接獲得連接體。然后用此連接體再次同源檢索、拼接，重復以上過程直至無棉花的重疊EST檢出，最終獲得陸地棉GhNIP5.1基因的cDNA序列片段。再以此片段在NCBI中進行Blastx同源性檢索，與其他物種的水通道蛋白進行序列比較，進而判斷拼接得到的陸地棉GhNIP5.1基因的cDNA的正確性及其ORF序列的完整性。然后用DNAS-tar軟件分析該序列，并將ORF翻譯成氨基酸序列。

1.2 蛋白質生物信息學預測與分析

用ProtParam對蛋白質進行基本特性分析;利用SOPMA軟件對蛋白質二級結構的組成形式進行分析;用TMHMM-2.0預測蛋白質的跨膜結構域;用NCBI的 Blast P對氨基酸序列進行蛋白質保守區分析;用NetPhos 2.0 Server預測蛋白質翻譯后的磷酸化修飾位點;用PSORT進行信號肽及亞細胞定位分析。

1.3 氨基酸序列同源和進化分析

用DNAMAN V6軟件對棉花GhNIP5.1蛋白的氨基酸序列和擬南芥AtNIP家族蛋白質的氨基酸序列進行同源性分析，并構建同源樹;用MEGA4軟件，采用Neighbor-Joining法對NCBI數據庫中獲得的其他植物NIP5.1蛋白和棉花Gh-NIP5.1蛋白構建進化樹。

1.4 基因結構分析

棉花D亞組雷蒙德式棉(Gossypium raimondii)基因組DNA已經測序并部分公布(http://www.phytozome.net/cotton.php)，根據獲得的 GhNIP5.1基因的 ORF序列，在已公布的棉花基因組序列中搜尋 GhNIP5.1基因序列，通過DNAStar軟件分析GhNIP5.1基因的外顯子和內含子的大小及分布情況。

2 結果

2.1 棉花GhNIP5.1基因的電子克隆結果

利用擬南芥AtNIP5.1(GenBank登錄號:NM_117106)基因序列為種子序列，在棉花EST數據庫中進行Tblastx同源性檢索，得到56條長度不一的棉花EST序列，將這些EST序列拼接獲得連接體，將這個連接體再次在棉花EST數據庫中進行Tblastx同源性檢索，將獲得的EST序列再次拼接;重復以上過程，直到序列不能再延伸為止，最終獲得1條長度為1 303 bp的cDNA序列。DNAStar軟件分析發現，該序列包含1個897 bp的ORF，翻譯后的氨基酸序列有298個氨基酸殘基構成，與擬南芥AtNIP5.1蛋白氨基酸序列一致性達到83.2%，將該序列命名為GhNIP5.1。

2.2 棉花GhNIP5.1蛋白基本特性分析

由GhNIP5.1基因的cDNA序列推測GhNIP5.1蛋白由298個氨基酸殘基構成，利用ProtParam分析該蛋白的基本理化性質，結果表明，GhNIP6.1成熟蛋白質的分子量是30 970，理論等電點為8.57;該蛋白質含 Ala(A)最多，占13.8%，不含有Pyl(O)和Sec(U)，負電荷的氨基酸殘基數(Asp+Glu)是16，正電荷的氨基酸殘基數(Arg+Lys)是19;脂肪系數為91.97，表明其為脂溶性蛋白;總平均親水性為0.410，該蛋白屬于疏水性蛋白;不穩定系數是31.36，表明該蛋白是穩定蛋白。

2.3 棉花GhNIP5.1蛋白二級結構分析

利用SOPMA在線分析GhNIP5.1蛋白的二級結構，結果表明，該成熟蛋白質主要由α-螺旋、延伸直鏈、β-轉角和無規則卷曲4種結構形式構成。這4種結構的氨基酸組成及占全部氨基酸的比例分別為:α-螺旋包含105個氨基酸，約占35.23%;延伸直鏈包含49個氨基酸，約占16.44%;β-轉角包含9個氨基酸，約占3.02%;無規則卷曲包含135個氨基酸，約占45.30%?？梢姡瑹o規則卷曲區間是該蛋白質二級結構的主要組成部分。

2.4 棉花GhNIP5.1氨基酸序列跨膜結構及保守區預測

用TMHMM-2.0對GhNIP5.1蛋白氨基酸序列跨膜結構域預測，結果顯示，該成熟蛋白質具有5個跨膜螺旋(TM1～TM5)，由4個環相連，其中蛋白質的N末端和環B、D都在細胞膜外，C末端和環A、C位于細胞膜內，N末端有73個氨基酸，C末端有18個氨基酸。用Blast P在NCBI的蛋白質保守區數據庫對GhNIP5.1氨基酸序列進行分析，結果顯示，該氨基酸序列的65～227位區段與MIP超家族相匹配，具有MIP家族典型的NPA(Asp-Pro-Ala基序)保守肽段和兩親性通道，由此推測該基因是水通道蛋白基因家族的一員。

2.5 棉花GhNIP5.1蛋白翻譯后修飾預測

用NetPhos 2.0 Server預測GhNIP5.1蛋白翻譯后修飾的磷酸化位點，結果表明，32、34、39、99、160、185 和295 位的7 個Ser(絲氨酸)，6、8、19、147、246 位的5 個 Thr(蘇氨酸)和35 位的Tyr(色氨酸)可能發生翻譯后的磷酸化修飾。由PSORT軟件預測信號肽及亞細胞定位，結果表明，GhNIP5.1的氨基酸序列沒有信號肽殘基，該蛋白質最有可能定位在質膜上。

2.6 棉花GhNIP5.1蛋白的進化樹和同源樹分析

棉花GhNIP5.1蛋白的氨基酸序列與NCBI數據庫已公布的NIP5.1蛋白的擬南芥(Arabidopsis thaliana，登錄號:NP_192776)、大豆(Glycin max，登錄號:XP_003535560)、蓮花(Lotus japonicus，登錄號:ABY19373)、葡萄(Vitis vinifera，登錄號:XP_002276319)和玉米(Zea mays，登錄號:NP_001150784)的氨基酸序列的一致性分別為83.2%、74.8%、71.1%、89.3%和42.7%。進化樹分析結果表明，棉花與葡萄聚到一個分支，進化關系最近，與玉米的進化關系最遠。

2.7 棉花GhNIP5.1基因結構分析

在棉花基因組中搜尋GhNIP5.1基因，結果表明，該基因編碼區全長2 067 bp，包含4個外顯子和3個內含子，所有內含子的左右邊界均為gt/ag結構。通過對比發現，棉花Gh-NIP5.1基因與擬南芥AtNIP5.1基因內含子和外顯子數量均相同，這兩個基因只有第一個外顯子長度存在18 bp的微小差異，其他3個外顯子長度均相當，造成基因結構差異的主要原因是內含子長度不同，尤其是第一個內含子有1 159 bp的長度差。

3 討論

用擬南芥AtNIP5.1(GenBank登錄號:NP_192776)的蛋白質序列在 HMMER(http://hmmer.janelia.org/)中進行同源檢索，結果顯示棉花中與之同源的序列有52條，其中與之同源性最高的是已公布的棉花NIP6.1(GenBank登錄號:DAA33875)的部分片段序列，但是在這些序列中并沒有GhNIP5.1的信息，由此表明，GhNIP5.1基因還沒有被克隆。

表達序列標簽(Expressed sequence tags，EST)是在來源于不同組織的cDNA文庫中隨機克隆，對所挑選的克隆進行單向測序后獲得的cDNA序列，長度一般在300～500 bp［10］?；虻碾娮涌寺【褪且訣ST數據庫為基礎，運用計算機分析技術進行新基因克隆的一種方法。通過生物信息學的方式向EST序列延伸，最終獲得新基因的部分或全長cDNA序列［11］。起初，隨著人類與小鼠、牛、線蟲和斑馬魚等多種模式生物的全基因組測序的完成，電子克隆作為克隆基因的新方法在模式生物上的應用相對比較廣泛［12］。隨著各種測序工作的開展，尤其是EST數據庫的不斷擴大和充實，電子克隆在小麥［13］、棉花［14］、大豆［15］和油菜［16］等植物新基因的獲取中都有應用。

AQPs是通道蛋白MIP家族成員之一，具有MIP家族結構的典型特征，最主要的是在其α-螺旋結構中包含有3個氨基酸殘基(Asp-Pro-Ala基序)構成的NPA模體，參與形成AQP水孔［5］。在GhNIP5.1氨基酸序列中就存在這個 NPA保守肽段，初步推斷它是屬于MIP家族成員的AQPs。磷酸化是植物AQPs水通道活性非常重要的調控方式，通過磷酸化，可以快速、直接、可逆地實現植物 AQP的門控調節［6］。預測GhNIP5.1蛋白存在有13個可能發生翻譯后修飾的磷酸化位點，這些位點的存在可能參與該水通道蛋白對水分或其他物質運輸的活性調節。這些結果提示該基因可能在棉花水分調控網絡中有著重要意義，為進一步深入探索該基因的功能奠定了基礎。

與棉花GhNIP5.1氨基酸序列一致性最高的是葡萄和擬南芥，分別達到89.3%和83.2%。擬南芥NIP家族與棉花GhNIP5.1 同源性最高的是 AtNIP5.1，由此推斷 GhNIP5.1 和AtNIP5.1可能具有類似的生理學功能。AtNIP5.1是擬南芥根部主要的硼酸通道蛋白，對擬南芥在缺硼條件下根系對硼的有效吸收以及植株正常的生長發育至關重要［7］。那么，棉花GhNIP5.1是否也與AtNIP5.1一樣是硼酸通道蛋白呢?還需要深入研究。

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