mir-183在食管鱗癌組織中的表達及其與患者預后的關系

彭兵鋒 凌志強 羅君 袁嘉敏 鄭志國 毛偉敏

mir-183在食管鱗癌組織中的表達及其與患者預后的關系

彭兵鋒 凌志強 羅君 袁嘉敏 鄭志國 毛偉敏

目的 探討原發性食管鱗癌（ESCC）組織中mir-183的表達及其與患者臨床病理特征、基因表達及預后之間的關系。方法 檢測83例ESCC組織及癌旁正常組織中mir-183以及基因的表達狀況，并對患者的臨床病理特征及預后進行分析。結果 83例標本中mir-183表達上調51例（61．4%），mir-183表達的上調與ESCC患者的淋巴結轉移、拓撲異構酶Ⅱ（TopoⅡ）表達及不良預后有關（均P＜0．05）。結論 mir-183的表達上調與ESCC的淋巴結轉移及TopoⅡ的表達狀況有關，并提示預后不良。

mir-183 食管鱗癌 淋巴結轉移 拓撲異構酶Ⅱ 預后

食管癌是常見的惡性腫瘤之一。目前，對于食管癌的早期診斷及治療較以往已取得巨大進步，但術后生存率仍不容樂觀，其發生、發展的機制仍有待進一步研究和探討[1]。近年來，關于microRNAs（miRNAs）的研究被廣泛關注，其在腫瘤中的作用機制也成為科研熱點。miRNAs是新近發現的一組天然豐富的小RNA，長度約17～25個核苷酸，新近研究表明miRNAs屬于表觀遺傳學的范疇[2-3]。miRNAs在腫瘤的演變過程中的作用類與癌基因或抑癌基因相似[4-6]。mir-183是miRNAs家族的一員，有研究指出，mir-183的異常表達與腫瘤發生、發展有關[7-8]。但是，有關mir-183的異常表達在原發性食管鱗癌（ESCC）的演變過程中的作用及其機制尚有待研究。在中國，食管癌的主要病理類型是ESCC，食管腺癌主要發生于西方國家[9]。本文通過檢測ESCC組織及相應癌旁正常組織中mir-183的表達狀況，探討原發性ESCC患者組織中mir-183的表達狀況及其與食管癌臨床病理特征及預后之間的關系。

1 材料和方法

1.1 材料 選擇2009-07—2010-09浙江省腫瘤醫院食管癌手術后組織標本及相應癌旁正常組織，患者術前均未接受化療或放療83例。其中男72例，女11例，年齡41～74歲（≥60歲36例，＜60歲47例）；高/中分化64例，低分化19例；上/中段病變35例，下段病變48例；Ⅰ/Ⅱ期34例，Ⅲ/Ⅳ期49例；伴有淋巴結轉移52例，無淋巴結轉移31例。癌旁正常組織取自腫瘤邊緣5cm外區域，為肉眼下正常組織，上述組織切除后，快速用液氮冷凍并儲存于-80℃冰箱中用作RNA提取。全部腫瘤組織均經病理診斷為鱗狀細胞癌，腫瘤分級、TNM分期分別按照2009年國際抗癌聯盟的標準。對該83例患者術后進行隨訪，隨訪時間截至2011-10-15。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 RNA提取試劑盒MiRNeasy Mini Kit購于德國Qiagen公司，瓊脂糖、0.5%TBE液、EB液、反轉錄試劑盒PrimeScriptRmiRNA cDNA Synthesis Kit（D350A）和real time RT-PCR試劑盒SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ（DRR081A）購于日本TaKaRa公司。引物由上海Invitrogen公司合成。Real time RT-PCR上游引物序列：mir-183：5′-TATGGCACTGGTAGAATTCACT-3′，對照組U6：5′-CGCTTCGGCAGCACA TATAC-3′，下游通用引物由反轉錄試劑盒PrimeScriptRmiRNA cDNA Synthesis Ki（tD350A）提供。按照MiRNeasy Mini Kit試劑盒說明書提取ESCC組織及其癌旁組織的總RNA，紫外分光光度計測量，判定所取總RNA的濃度和純度，要求光密度值A260/A280＞1.8。取1μl RNA溶液與1.5%的變性瓊脂糖凝膠中進行電泳，測定所提RNA的完整性。

1.2.2 逆轉錄 取1μg總RNA使用PrimeScriptRmiRNA cDNA Synthesis Kit試劑盒進行cDNA的合成，具體操作參照使用說明。

1.2.3 PCR擴增 Real time RT-PCR的PCR擴增及溶解曲線分析均使用ABI 7500PCR儀（Applied Biosystems），采用20μl的反應體系，具體操作參照SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ的使用說明。反應過程具體為：50℃激活聚合酶2min，95℃預變性1min；95℃變性5s，60℃退火和延伸34s，擴增40個循環。結束后通過95℃15s，60℃1min，85℃15s，60℃15s制作溶解曲線。應用實時RTPCR方法及2-ΔΔCT法對檢測出的ESCC患者癌組織及癌旁正常組織中mir-183的表達狀況進行分析（表達上調：ΔΔCT＜-1，表達下調：ΔΔCT＞1，正常表達：-1＜ΔΔCT＜1）。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件，不同臨床病理特征和基因表達情況者之間的比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，生存曲線用Kaplan-Meier法進行單因素生存分析，對數秩檢驗進行生存曲線比較，多因素分析采用Cox比例風險模型。

2 結果

2.1 mir-183在ESCC組織中的表達 mir-183表達下調8例，表達正常24例，表達上調51例。

2.2 mir-183表達上調與ESCC的臨床病理特征及基因表達的關系 見表1、2。

由表1可見，mir-183的表達上調與ESCC的淋巴結轉移有關（P＜0.05），而與年齡、性別、分化程度、腫瘤位置、腫瘤浸潤、遠處轉移、TNM分期無關（均P＞0.05）。由表2可見，mir-183的表達上調與TopoⅡ的表達狀況差異有統計學意義（P＜0.05），而與p53、CerbB-2、MRP的表達狀況無關（P＞0.05）。

表1 mir-183的表達上調與ESCC的臨床病理特征的關系

表2 mir-183的表達上調與基因表達的關系

2.3 mir-183表達上調與患者預后的關系 在51例mir-183表達上調的ESCC患者中復發、轉移及死亡總數為42例（82.4%），而32例非表達上調的ESCC患者中復發、轉移及死亡總數為15（46.9%），提示mir-183的表達上調與ESCC的不良預后相關（圖1）。Cox模型回歸多因素分析結果顯示，mir-183的表達上調與區域淋巴結轉移、遠處轉移及ToPoⅡ的表達一起作為ESCC患者預后的影響因子（P＜0.05，表3）。

圖1 mir-183的表達上調與ESCC患者在生存率的生存曲線

表3 mir-183的高表達與臨床病理特征的COX多因素分析

3 討論

本實驗采用real time RT-PCR方法檢測了83例原發ESCC組織及相應的癌旁正常組織中mir-183的表達水平，并用2-ΔΔCT法測定83例ESCC組織及癌旁組織中mir-183的表達差異，結果說明mir-183在癌組織中的表達較癌旁正常組織為高[10-13]。

在與臨床病理特征關系的統計學分析中發現，有淋巴結轉移的ESCC標本中mir-183的表達上調率明顯高于無淋巴結轉移組，說明mir-183表達上調與ESCC中淋巴結轉移相關[12-14]，另外，在與基因的表達狀況的統計分析中發現，TopoⅡ陽性的ESCC組織中mir-183的表達上調率也較TopoⅡ陰性為高。說明mir-183表達上調與ESCC中TopoⅡ的表達相關[15-16]。在mir-183的表達上調與ESCC患者預后的相關性方面，我們對患者術后生存時間進行隨訪，并采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線、對數秩檢驗進行生存曲線比較，分析mir-183的表達上調與ESCC患者預后之間的關系。結果顯示，到2011-10隨訪截止時，mir-183表達上調組的ESCC患者的病死率高于非表達上調組，mir-183表達上調組的ESCC患者的中位生存時間明顯比非表達上調組短。ESCC患者預后的Cox模型回歸多因素分析結果顯示，mir-183的表達上調與淋巴結轉移、遠處轉移及TopoⅡ的表達一起作為ESCC患者預后的影響因素（P＜0.05）。因此，本研究結果證實了mir-183的表達上調可能是ESCC患者的一個預后不良因子[8，13]。

總之，mir-183的表達上調在ESCC中是一個頻發事件，mir-183的表達上調與ESCC患者的淋巴結轉移、TopoⅡ表達相關，并提示不良預后。因此，mir-183可能是ESCC的預后因子之一。有關mir-183的表達上調與在ESCC中的作用機制的研究尚處于起步階段，mir-183在ESCC發生、發展過程中的作用及其機制還有待深入研究和探討，這將會為ESCC患者的預后評估提供更多理論指導。

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Expression of microRNA-183 in esophageal squamous cell carcinoma and its correlation with disease prognosis

Objective To investigate the expression of microRNA-183(mir-183)in esophageal squamous-cell carcinoma（ESCC）and its correlation with disease prognosis．MethodsThe expression of mir-183 was detected by real-time RT-PCR and immunohistochemistry in 83 ESCC tissue specimens and corresponding pericancerous tissues．ResultsAmong 83 ESCC samples mir-183 was significantly up-regulated(2～6411-fold)in 51 cases compared to the matching pericancerous tissues．Up-regulation of mir-183 expression was correlated with lymph node metastasis,expression of ToPoⅡand poor prognosis in ESCC patients(all P＜0．05)．ConclusionUp-regulation of mir-183 expression may indicate the poor prognosis of patients with esophageal squamous cell carcinoma．

Mir-183 ESCC Lymph node metastasis TopoⅡ Prognosis

2011-12-15）

（本文編輯：楊麗）

衛生部科研基金資助項目（WKJ2010-2-004）；浙江省自然科學基金資助項目（Y2080749，Y2091110）；浙江省科技計劃基金資助項目（2009C33143）

325000 溫州醫學院附屬第一醫院腫瘤外科（彭兵鋒，系碩士研究生）；浙江省腫瘤醫院（凌志強、鄭志國、毛偉敏）；浙江中醫藥大學研究生部（羅君、袁嘉敏）

毛偉敏，E-mail：maowm1218@163.com