新的MEN1基因剪切突變導致多發性內分泌腺瘤病I型的家系研究

徐海燕 喬潔 韓兵 陳凱 夏蘇嬌 劉炳麗 郭郁郁 陸穎理 吳萬齡

新的MEN1基因剪切突變導致多發性內分泌腺瘤病I型的家系研究

徐海燕 喬潔 韓兵 陳凱 夏蘇嬌 劉炳麗 郭郁郁 陸穎理 吳萬齡

目的 對1例多發性內分泌腺瘤病I型（MEN1）患者進行基因診斷和家系成員的隨訪。方法收集MEN1患者的臨床及家系資料，抽取先證者及5位家系成員外周血提取DNA，對MEN1基因的10個外顯子進行PCR擴增，用全自動測序儀進行測序分析。結果（1）經MEN1基因突變檢測證實,先證者存在內含子5剪切位點的突變（IVS7+2 T→G）。（2）先證者無臨床表現的兒子也攜帶此突變，在基因診斷7個月后出現了明顯的臨床表現，術后病理證實為胰島β細胞瘤和左腎上腺腺瘤。結論臨床醫師應常規對所有MEN1患者及其家系高危成員盡早進行基因突變分析和篩查，并嚴格隨訪，從而改善疾病的預后。

多發性內分泌腺瘤病1型 MEN1基因 突變

多發性內分泌腺瘤病I型（MEN1）為一種常染色體顯性遺傳性疾病，發病率約為1/3萬～1/5萬。患者主要表現為甲狀旁腺腺瘤、胰島細胞瘤和垂體前葉腫瘤，還可能存在脂肪瘤、胸腺類癌、嗜鉻細胞瘤、腎上腺瘤等其他少見類型的腫瘤[1-2]。MEN1預后和早期診斷、治療密切相關，而分子生物學技術為臨床診斷開辟了新的途徑，使該病早期診斷成為可能，大大提高了疾病的預后。本研究對麗水市中心醫院收治的1例MEN1的患者及家系成員進行研究，發現了一種新的剪切位點突變，并對其家系成員進行了隨訪觀察。

1 對象和方法

1.1 對象 先證者，男，56歲。因“反復四肢乏力3年，加重10d”入院。患者于3年前出現四肢乏力，逐漸加重，起病第2天即不能站立行走，伴有四肢肌肉僵硬，于外院查血鉀2.3mmol/L，診斷為低鉀血癥，予補鉀治療后2d癥狀好轉。此后癥狀反復發作，毎于勞累后易發，1年2～3次不等，補鉀后癥狀均能緩解。10d前四肢乏力再發，伴有咳嗽、咯痰。追問病史，患者8年前開始出現反復意識不清，近2年逐漸加重，進食后可緩解，未予正規診治。入院體檢：BP115/70mmHg，BMI 19.8，精神疲軟，咽輕微充血，甲狀腺I度腫大，質中，未觸及結節，無壓痛，隨吞咽上下活動。雙肺呼吸音清，未聞及干濕啰音。心率76次/min，律齊，未聞及病理性雜音。腹軟，中上腹深壓痛，肝脾肋下未及。無顏面及雙下肢水腫。左大腿后部可捫及一15cm×15cm腫塊，質軟，邊界清，基底部寬，無壓痛，活動度尚可。四肢肌張力正常，足背動脈搏動正常，病理征陰性。實驗室檢查：T31.52ng/ml，FT32.98 pg/ ml，TSH 1.69μIU/ml；血常規：WBC 7.4×109/L，血鉀2.24mmol/L，血鈣 2.89mmol/L，血糖 1.8mmol/L，PTH 179pg/ml，胃泌素1 292.9pg/ml，臥位醛固酮219.5pg/ml，立位醛固酮1 318.9pg/ml。立、臥位試驗顯示，患者血清腎素活性臥位5.25ng/（ml·h）[參考標準：0.05～0.79ng/（ml· h）]，立位2.74ng/（ml·h）[參考標準：1.95～3.99ng/（ml· h）]，血管緊張素臥位64.36 pg/ml（參考標準：28.2～52.5pg/ml），立位＞800ng/ml（參考標準：55.3～115.2 ng/ ml）。心電圖示竇性心率，ST-T改變，Q-T間期延長。B超：甲狀腺右葉中級背側21cm×11cm低回聲光團。右腎鈣化灶，雙腎多發結石，右腎盂積水，膀胱占位病變。ECT示甲狀旁腺腺瘤。MRI：雙腎上腺占位，轉移瘤可能大，胰頭形態不規則增大，腫瘤可能，左腎多發結石，右壺腹型腎盂，脾臟、肝臟小結節低密度灶（圖1）。膀胱CT：膀胱右側底部占位，前列腺鈣化。予補鉀、對癥治療，住院期間出現解水樣便伴惡心、嘔吐，顏面潮紅，大便常規陰性，培養無殊，考慮類癌綜合征，加用奧曲肽抑制胰液分泌，賽庚啶抗5-HT治療后，腹瀉好轉，無惡心、嘔吐，無多飲、多尿，但一般情況差，精神萎。復查電解質示血鉀 2.2mmol/L，血鈉 126mmol/L，游離鈣1.52mmol/L，患者及家屬拒絕胃鏡及相關病理檢查，自動出院。患者父母及1妹1弟均體健，育有2女1子，1女兒13年前死于“腎上腺腫瘤（性質不詳）”。家系圖譜見圖2。

圖1 先證者及其兒子的影像學表現（a、b：先證者的MRI顯示胰頭形態不規則增大；c、d：先證者兒子的腹部CT顯示有左腎上腺腺瘤）

1.2 方法

1.2.1 家系調查 對患者進行家系調查。

圖2MEN1患者的家系圖

1.2.2 分子生物學檢查 抽取先證者及5位一級親屬外周抗凝血5ml，采用標準的酚/氯仿抽提法提取人血白細胞基因組DNA。對MEN基因的10個外顯子進行PCR擴增，引物序列用Primer Express2.0軟件進行設計，擴增片段包括10個外顯子區域以及外顯子和內含子的交界區，產物長度為367～717bp。引物序列見表1。20μl PCR反應體系含基因組DNA 500 ng，寡核苷酸引物各0.5μl（100 pmol/L）。dNTP 0.5μl（200pmol/L），Taq DNA聚合酶2U及10×緩沖液2μl PCR反應參數：92℃預變性5min，92℃變性30s，60℃退火35s，72℃延伸60s，共35個循環，最后72℃延伸10min。PCR擴增產物蝦減酶純化后，應用ABI3730測序儀進行直接基因測序。樣本均經雙向測序，結果完全一致。

表1MEN1基因篩查引物

2 結果

2.1 分子生物學檢查結果 對5位一級親屬進行基因篩查，發現患者及其兒子在MEN基因的第7號內含子的剪切位點上存在T→G的雜合突變（IVS7+2 T→G），其余外顯子及附近內含子區域經測序未發現突變（圖3）。其余家系成員包括患者的父母以及患者同胞弟弟和妹妹均未發現攜帶該基因突變。

圖3 患者MEN1基因外顯子7與內含子7交界處測序結果

2.2 家系調查和隨訪結果 先證者的父母及1妹1弟均體健，先證者育有2女和1子。據家屬告知1女兒16歲起病，當時有高血壓、腹痛、腹瀉等表現，外院影像學檢查疑為“腎上腺腫瘤”，未經特殊治療，后死亡。另一女兒暫無明顯內分泌異常的表現。

先證者的兒子，30歲。在我們進行基因診斷時，尚無明顯的臨床表現。2009年11月起出現晨起時意識障礙，呼之不應，四肢能活動，但動作不協調，伴有大量出冷汗，每次持續半小時后意識轉請，有頭暈、頭痛，約3～5d發作一次，查FPG1.61mmol/L，血鉀3.83mmol/L，血鈉140mmol/L，血鈣2.27mmol/L，甲狀旁腺素49.1pg/ml，空腹胰島素62mIU/L，臥位醛固酮154.80 pg/ml，立位醛固酮198.9pg/ml，血漿腎素活性10.28ng/ml/h，ACTH（上午8：00）18.8pg/ml，皮質醇（上午8：00）11.8 μg/dl，皮質醇（午夜0：00）7.1 μg/dl，24h尿皮質醇376.72μg，患者的血電解質、性激素和甲狀腺功能均正常。腹部CT檢查發現左腎上腺結節和胰腺頸部腫塊（圖1）。于2010年1月行胰腺腫瘤及左腎上腺腫瘤切除術，術后FPG5.5 mmol/L，空腹胰島素27.9mIU/L。病理：胰腺內分泌腫瘤（3.5cm×2.5cm×1.5cm），左腎上腺皮質腫瘤（1.0cm× 0.8cm×0.5cm），免疫組化CK（+）、CgA（+）、Syn（+）、CD56（+）、Ki-67（+）（10%）、EMA（-）。對胰腺腫瘤進行胰島素和胰高糖素的免疫組化顯示，胰島素染色陽性，而胰高糖素的染色為陰性（圖4）。

3 討論

MEN是一組以多個不同的內分泌腺在同一個體先后或同時發生、以功能亢進為主要表現的遺傳性疾病。最近Lemons等[3]報道在MEN1患者中，最常見的為甲狀旁腺腺瘤導致的高鈣血癥，在95%的患者中出現，40%的患者發生胰腺胰島細胞腫瘤，包括胃泌素瘤、胰島細胞瘤、胰多肽瘤，而30%的患者發生泌乳素瘤、生長激素瘤、ACTH瘤或無功能腺瘤等腺垂體腫瘤。同時，還發現在MEN1基因突變的攜帶者中，58%有臨床表現，13%有生化異常，而29%的攜帶者既無臨床表現也無生化異常。因此，有必要在MEN1的家系中進行基因篩查，即使這些家系成員沒有明顯的臨床表現和生化異常。

圖4 胰腺和腎上腺腫瘤的組織學表現（a:胰腺腫瘤切片HE染色；b:腎上腺腫瘤切片HE染色；c:胰腺腫瘤胰高糖素染色陰性；d:胰腺腫瘤胰島素染色陽性。a、b×200；c、d×400）

本研究的先證者表現為甲狀旁腺腺瘤、腸胰內分泌腫瘤，且伴有廣泛轉移，左大腿部腫瘤可能為脂肪瘤。低血鉀的原因似乎與醛固酮升高有關，但患者無明顯高血壓表現，且其腎素-血管緊張素水平升高，考慮為腹瀉導致的容量不足導致繼發性醛固酮增多。患者女兒死于腎上腺腫瘤，發病年齡輕，當時未對其他內分泌腺體進行檢查。患者兒子在基因診斷時尚無明顯臨床表現，但7個月后出現了低血糖癥狀，經進一步檢查發現存在胰腺的β細胞瘤和左腎上腺的腫瘤。MEN1中最常見的內分泌異常以甲狀旁腺和胰腺多見，腎上腺較為少見，據目前的報道為9%～55%，且多數為無功能性腫瘤。Schaefer等[4]通過超聲內鏡技術發現MEN1中腎上腺累及的占73%，高于以往的報道，但僅有2例患者是有分泌活性的內分泌系統累及（且為由于雙側腎上腺增生導致的非ACTH依賴性的Cushing綜合征）。先證者的腎上腺改變亦為雙側性，影像學表現支持轉移性腫瘤。此外，患者有嘔吐、腹瀉、潮紅和低血鉀表現，不能排除胰腺的VIP瘤或胃泌素瘤，但因先證者未經手術治療，無病理學依據進一步證實。

在不同的種族中，目前已確定生殖細胞水平的MEN1基因雜合突變是導致多發性內分泌腺瘤病的主要原因。MEN1基因位于染色體11q13，全長9kb，包含10個外顯子，編碼含有610個氨基酸的蛋白minin[5]。目前認為minin是一種腫瘤抑制因子，在成人的各種組織均有廣泛表達，與轉錄調節、基因組的穩定性、細胞的增殖和分裂密切相關。目前已報道的MEN突變有400余種，23%為無義突變，41%為導致移碼的缺失或插入，6%框內缺失或插入，20%為錯義突變,9%為剪切位點突變，1%為全部或部分基因的缺失[3，6-7]。國內也有10余種突變類型的報道，多為無義突變、錯義突變、插入、缺失突變，但少有剪切位點的突變。Jiang等[8]報道的8個MEN家系中，發現了8種突變類型，有373_374ins18，822delT，259delT，1092delC，357_360delCTGT，427_ 428delTA和R108X（CGA→TGA）。而Tso等[9]在臺灣報道的8個家系中，發現最常見的是插入突變1650insC（在3個家系檢測到），另外還有D418H（GAG→TAG），G110E（GGG→GAG），1 200del 11/ins 7 bp（del TTCTTTGAAGT）（ins ATCTACA）以及Intron 4，IVS4-9（G→A）。與MEN2a不同，中國人Ret基因突變存在突變熱點，均為密碼634突變，而MEN1突變散在分布，在目前中國大陸報道的患者中未發現帶有同樣突變的兩個家系。

本研究在一中國人家系中發現了內含子7中存在剪切位點的突變，將導致MEN1基因mRNA剪切異常，從而影響minin蛋白的功能。由于真核基因轉錄后需要把內含子切除而把外顯子連接起來才能產生成熟的mRNA分子，這個過程稱為剪接。對400個脊椎動物的基因進行分析發現，正確的剪切要求剪切小體識別特征性的共有序列。大部分內含子的兩端分別是GT和AG，其中在內含子5′端與外顯子交界的部位有一段保守序列,含有GT約為10bp（-4到+6），為mmAG GTrAGT（m為C或A，而r為A或G），被稱為剪接供位（donor）；而在內含子的3′端與外顯子的交界部位，也有一段保守的區域（-14到+1），包含AG及上游有一個富含嘧啶的區域，構成剪接受位（acceptor）。此外，在內含子近3′端，往往位于3′剪接位點的上游50個堿基左右的范圍內，還有一個高度保守的堿基A，形成剪切時的分支點。這幾個部位堿基對mRNA的正確剪接具有重要的意義。此患者MEN基因突變位于高度保守的剪切供位，將會對MEN基因mRNA的剪切產生影響，可能導致越過外顯子7，生成截短的minin蛋白。

最近Pieterman等[10]報道的74例MEN1患者中，其中30例經基因診斷而無臨床表現的患者中，11例在隨訪的過程中發病，但無一例死亡，充分證明基因診斷作為一種簡單易行的方法在MEN家系的早期診斷中起了重要的作用，并極大地改善了患者的長期預后。因此，對MEN1的家系成員雖無臨床和生化異常，也應常規進行基因篩查，并制定一套完整的隨訪和檢測計劃，從而改善疾病的預后。

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A novel splice site mutation of MEN1 gene detected in a pedigree of multiple endocrine neoplasia type 1

ObjectiveTo investigate mutations of MEN1 gene in a pedigree of multiple endocrine neoplasia type 1(MEN 1)．MethodsA patient with MEN 1 and his family members were enrolled in the study．Peripheral blood samples were collected and total genomic DNA was prepared for polymerase chain reaction(PCR)．PCR products of 10 exons of MEN1 gene were purified and gene sequence analysis was performed．ResultsA splice site mutation of intron 7(IVS7+2 T→G)were detected in the proband and his son,in whom clinical manifestations presented 7 months after genetic diagnosis,and insulinoma and left adrenal adenoma were then confirmed pathologically．ConclusionMEN1 patients may carry MEN1 mutations，which should be screened in their family members for early diagnosis and treatment．

Multiple endocrine neoplasia type 1 MEN1 gene Mutation

2012-02-06）

（本文編輯：沈昱平）

國家自然科學基金項目（81070666）

323000 麗水市中心醫院內分泌科（徐海燕、陳凱、夏蘇嬌）；上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院（喬潔、韓兵、郭郁郁、陸穎理、吳萬齡）；上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院上海市內分泌研究所（劉炳麗）

喬潔，E-mail：Qiaoj2001@126.com