非小細胞肺癌EGFR基因第一內含子（CA）n多態性與基因突變及預后的關系

王烈 樂涵波 何劍營 陳冬冬 續力云 劉曉光 張永奎 竺王玉

●診治分析

非小細胞肺癌EGFR基因第一內含子（CA）n多態性與基因突變及預后的關系

王烈 樂涵波 何劍營 陳冬冬 續力云 劉曉光 張永奎 竺王玉

目的 研究非小細胞肺癌（NSCLC）患者表皮生長因子受體（EGFR）基因第一內含子（CA）n[intron 1（CA）n]多態性與EGFR基因突變的關系，并觀察患者的預后。方法觀察129例NSCLC患者生存情況，檢測患者手術切除新鮮癌組織或石蠟包埋組織EGFR基因intron 1（CA）n及19、21外顯子突變。結果129例NSCLC患者中，檢出EGFR基因突變35例（27．1%），其中EGFR19外顯子21例（16．3%），21外顯子15例（11．6%）。EGFR intron 1（CA）n出現頻率最多的等位基因為（CA）20（38．8%），其次為（CA）16（26．4%）。短（CA）n與EGFR基因突變有關，特別是19外顯子突變，差異有統計學意義（均P＜0．05），但與21外顯子突變無明顯相關，差異無統計學意義（P＞0．05）。（CA）16與19外顯子突變有關，差異有統計學意義（P＜0．05）。EGFR基因intron 1短（CA）n與長（CA）n NSCLC患者總生存時間差異無統計學意義（P＞0．05）。結論EGFR第一內含子短（CA）n，特別是（CA）16重復序列可能是影響19外顯子缺失突變的一個重要因素。（CA）n多態性不是NSCLC患者預后的危險因素（P＞0．05）。

非小細胞肺癌 表皮生長因子受體 單核苷酸多態性 基因突變

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the relationship among epidermal growth factor receptor(EGFR)gene intron 1(CA)n polymorphisms,gene mutations and prognosis in patients with non-small cell lung cancer(NSCLC)．MethodsThe EGFR gene intron 1(CA)n polymorphisms,exons 19 and 21 mutation in fresh tissue or paraffin-embedded tissue sections were amplified with PCR,followed by direct sequencing in 129 surgically-removed specimens of NSCLC．ResultsEGFR mutations were detected in 35 of 129(27．1%)patients with NSCLC．There were 21 cases(16．3%)with mutations in exon 19 and 15 cases(11．6%)with mutations in exon 21．EGFR intron 1(CA)n was occurred more frequently in(CA)20 allele(50/129,38．8%）,followed by(CA)16 allele (34/129,26．4%)．A genetic association was found between shorter CA alleles and EGFR mutations,especially exon 19 mutations (P＜0．05),but not exon 21 mutation(P＞0．05)．(CA)16 allele conferred high capability for retaining EGFR exon19 mutation(P＜0．05)．There was no significant difference in the overall survival time between patients with EGFR intron 1 short(CA)n polymorphisms and with long(CA)n polymorphisms(P＞0．05)．ConclusionEGFR intron1 short(CA)n，especially(CA)16 polymorphisms may be involved in the accumulation of the EGFR exon 19 deletions during lung cancer development and(CA)n polymorphisms may be not associated with the prognosis of patients with NSCLC．

近年來，表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶結構域體細胞突變的發現及其抑制劑的成功使用為肺癌患者治療帶來了新的希望。該突變90%為21外顯子L858R點突變及19外顯子缺失突變[1]。但是，在肺癌進展過程中，如何發生EGFR突變，還未可知。目前觀察到，EGFR突變主要發生于女性及亞洲人種[2-3]，說明EGFR突變與種系有很大關系。已有研究表明EGFR呈現高度多態性，而且其表達受其多態性調控，特別是EGFR基因第一內含子（CA）n[intron 1（CA）n]與EGFR表達量呈顯著負相關[4]，但有關intron 1（CA）n與EGFR突變的關系還未見有系統的分析研究。本研究探討非小細胞肺癌（NSCLC）患者EGFR基因intron 1（CA）n多態性與EGFR突變情況及患者預后的關系。

1 材料和方法

1.1 材料 選取2006-06—2012-07在舟山醫院進行手術治療的NSCLC患者未進行放療、化療或其他抗腫瘤治療的患者351例，采用簡單隨機抽樣方法選取129例。其中男83例，女46例，年齡31～82（59.4±4.1）歲；129例患者經手術切除的肺癌組織（新鮮組織99例，石蠟包埋組織30例）均經切片及HE染色，由2位病理醫師診斷為NSCLC，并證實其中含有80%以上腫瘤組織。其中腺癌70例，鱗癌47例，原位腺癌12例；低分化65例，中-高分化64例；淋巴結轉移43例，未發生淋巴結轉移86例；Ⅰ/Ⅱa期75例，Ⅱb/Ⅲ/Ⅳ期54例。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 取新鮮腫瘤組織30mg，研磨棒研碎，用DNA MINI kit（德國Qiagen公司）提取DNA；石蠟包埋組織制成10μm切片，用DNA FFRPE Tissue kit（德國Qiagen公司）提取DNA，操作均嚴格按照試劑說明書進行。提取的DNA用1.2%瓊脂糖凝膠鑒定，Q-3000微量紫外分光光度計（美國Quawell Technology，Inc公司產品）測定DNA含量。

1.2.2 聚合酶聯反應（PCR）擴增和測序 采用PCR方法擴增EGFR基因第一內含子、19外顯子及21外顯子。EGFR intron1（CA）n上游引物為5′-GGGCTCACAGC AAACTTCTC-3′，下游引物為5′-CAAGGTCTGGGAACCACTGT-3′，產物長度為405 bp；EGFR 19外顯子上游引物為5′-CCCCAGCAATATCAGCCTTA-3′，下游引物為5′-TGTG GAGATGAGCAGGGTCT-3′，產物長度為355bp；EGFR 21外顯子上游引物為5′-GAATTCGGATGCAGAGCTTC-3′，下游引物為5′-TCATTCACTGTCCCAGCAAG-3′，產物長度為441bp。PCR反應體系：10×Buffer 5μl，5×Q-Solution 10μl，100 mmol dNTP 0.1μl（美國ABI公司），2.5UHot-Star Taq DNA聚合酶（德國Qiagen公司），50 ng模板DNA 5μl，ddH2O補足體積至50μl。PCR反應條件：95℃15min；94℃15s，60℃30s，72℃1min，10個循環；94℃15s，56℃30s，72℃1min，25個循環；72℃10min。取5μl PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳（100V，30min），ChemiDoc凝膠成像儀判定擴增片段。

1.2.3 PCR產物純化及測序 用EasyPureTMPCR Purification Kit（北京全式金公司）純化PCR產物，嚴格按試劑說明書操作。測序反應PCR：1μl BigDye，0.5ml BigDye seqBuffer，1M引物（3.2pmoL/μl），1μl純化PCR產物，1.5μlddH2O。96℃1min；96℃10s，50℃5s，60℃4 min，25個循環，4℃恒溫，正反向測序。測序反應PCR產物用乙醇/EDTA沉淀法純化，Hi-Di Formamide溶解DNA后，95℃變性4 min，迅速置冰中冷卻4min，然后在ABI3100XL基因分析儀上樣電泳。

1.2.4 測序結果分析 采用ABI Sequencing Analysis V5.4軟件分析原始測序結果，ABI SeqScap軟件與EGFR序列進行比對分析，結合人工校對，判斷EGFR基因突變情況。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件，計數資料比較采用χ2檢驗（1≤T＜5且n≥40采用校正χ2檢驗，T＜1或n＜40采用Fisher精確概率法），均為雙側檢驗危險因素采用logistic回歸分析，生存率的比較采用kaplan-Meier法，組間比較采用Log-rank檢驗，預后因素采用Cox分析。

2 結果

2.1 NSCLC患者EGFR基因突變及長短intron1（CA）n多態性與臨床病理特征的關系 在129例NSCLC患者中，檢出EGFR基因突變35例（27.1%），其中EGFR19外顯子21例（16.3%）（圖1），21外顯子15例（11.6%）（圖2），頻率最多的EGFR intron 1（CA）n等位基因為（CA）20（50例，38.8%，圖3），其次為（CA）16（34例，26.4%，圖4）、（CA）19（11例，8.5%）、（CA）18（9例，7.0%）、（CA）21（8例，6.2%）、（CA）15（7例，5.4%）、（CA）17（7例，5.4%）、（CA）22（3例，2.3%）。根據患者EGFR intron 1（CA）n分布的中位數，將（CA）n分為短（CA）n組[（CA）n≤19）[和長（CA）n組[（CA）n＞19）]。NSCLC患者EGFR基因突變及長短intron 1（CA）n多態性與臨床 病理特征的關系見表1。

圖1 ERFR 19外顯子E746-A750del

圖2 EGFR 21外顯子L858突變

圖3 EGFR intron（CA）20重復多態性

圖4 EGFR intron（CA）16重復多態性）

由表1可見，NSCLC患者EGFR基因突變與性別、肺癌組織學類型、是否吸煙有關，差異有統計學意義（P＜0.05）。（CA）n等位基因與患者的年齡、性別、吸煙狀況、組織學類型、淋巴結轉移和臨床分期差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

2.2 NSCLC患者EGFR基因intron 1（CA）n多態性與突變的關系 見表2。

表2 NSCLC患者EGFR基因intron 1（CA）n多態性與突變的關系[例（%）]

由表2可見，NSCLC患者短（CA）n與EGFR基因突變有關，特別是19外顯子突變，差異有統計學意義（均P＜0.05），但與21外顯子突變無明顯相關，差異無統計學意義（P＞0.05）。其中（CA）16與患者19外顯子突變有關，差異有統計學意義（P＜0.05），而（CA）20的患者較少發生EGFR 19外顯子突變，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 NSCLC患者EGFR基因intron1（CA）n多態性與突變Logistic回歸分析見表3。

表3 NSCLC患者EGFR基因intron 1（CA）n多態性與突變Logistic回歸分析

由表3可見，將變量賦值：長（CA）n=0，短（CA）n= 1；其他=0，（CA）n=1，二元條件Logistic回歸分析顯示NSCLC患者EGFR基因（CA）16是EGFR突變，特別是19外顯子突變的危險因素（均P＜0.05）。

2.4 EGFR基因intron 1（CA）n多態性與NSCLC患者總生存時間的關系 Kaplan-Meier生存曲線結果顯示，自肺癌根治術后短（CA）n的NSCLC患者平均生存時間為54.65個月，短（CA）n患者平均生存時間為52.89個月，長（CA）n患者平均生存時間為57.25個月，差異無統計學意義（P＞0.05，圖5）。對總生存時間多因素COX回歸分析結果（表4）亦顯示，EGFR基因intron 1短（CA）n并不是NSCLC患者預后的危險因素（OR= 1.247，95%CI=0.660～2.355，P＞0.05）。

圖5 短（CA）n與長（CA）n NSCLC患者總生存時間的比較

表4 NSCLC患者術后總生存時間的Cox危險因素分析

3 討論

根據外顯子突變部位的不同，EGFR突變表現為各種不同的臨床模式，如在19外顯子上表現為片段缺失，在18及21外顯子上則表現在單核苷酸突變。有研究報道EGFR基因21外顯子突變主要發生在女性、非吸煙的腺癌患者，而19外顯子突變則與男性有關[5]。本結果顯示NSCLC患者EGFR突變與女性、非吸煙者及腺癌有關，與之前研究結果相一致[2-3]。EGFR第一內含子（CA）n重復序列多態性在本組中國人群中的分布主要為（CA）20，其次為（CA）16，與研究報道的東亞裔人群（CA）n分布一致[6]。

EGFR基因第一內含子中包含1個由9～23CA的短重復序列，其重復次數可影響基因的轉錄活性，與EGFR mRNA水平呈負相關，這可能是因為RNA延長終止的位點位于CA重復序列附近，那里有2個主要的獨立轉錄起始位點，當CA重復序列延伸時，EFGR多態性區域可以高度折疊，影響DNA螺旋，并增強阻遏蛋白的結合性，但其具體的確切機制尚不清楚[7]。有多項研究顯示NSCLC患者攜帶短CA重復序列與EGFR基因突變有關，特別是19外顯子突變，如Sueoka-Arangeane等[8]發現短CA重復序列與19外顯子缺失突變有關，同時攜帶短CA重復序列且發生19外顯子突變的肺腺癌患者EGFR mRNA轉錄水平要顯著高于攜帶長CA重復序列的患者；Liu等[9]發現NSCLC患者（CA）19重復是EGFR基因19外顯子突變的危險因素；Nie等[10-11]發現CA重復次數≤16的NSCLC患者EGFR蛋白表達增加，且攜帶短CA重復序列的患者經過吉菲替尼治療后存活明顯長于攜帶長CA重復序列的患者。本結果亦顯示短（CA）n與EGFR基因突變有關，特別是19外顯子缺失突變，而與21外顯子突變則無明顯關系。EGFR intron1（CA）16重復的NSCLC患者更易發生19外顯子缺失，是致EGFR突變的危險因素。研究發現EGFR 19外顯子缺失突變的NSCLC患者EGFR mRNA、蛋白表達水平顯著高于未發生突變者[12]，由此推測（CA）n重復序列多態性可能影響EGFR19外顯子缺失突變，進而影響其mRNA和蛋白的表達水平，并改變EGFR信號傳導通路的活性。但是，NSCLC患者EGFR intron1（CA）n重復序列多態性與總生存時間無明顯相關，并不是致肺癌患者死亡的危險因素，與之前研究結果相一致[13]。

可見，在NSCLC進展過程中，EGFR第一內含子短（CA）n，特別是（CA）16重復序列可能是影響19外顯子缺失突變的一個重要因素。有關其是否可預測EGFR酪氨酸激酶的療效還需進一步的研究證實。

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Relationship among epidermal growth factor receptor gene intron 1（CA）n polymorphisms,gene mutations and prognosis in patients with non-small cell lung cancer

Non-small cell lung cancerEpidermal growth factor receptorSingle polymorphism Gene mutation

2012-10-04）

（本文編輯：楊麗）

浙江省科技廳資助項目（2011C37030）

316004舟山醫院胸心外科（王烈、樂涵波、張永奎），免疫基因組學聯合實驗室（何劍營、陳冬冬、續力云、劉曉光、竺王玉）

竺王玉，E-mail：zhuwangyu24@gmail.com