乳腺癌組織中差異性微小RNA的血清學表達分析

邵營波，張 晟，劉 艷，劉晶晶，張霄蓓，張 瑾

本文要點微小RNA(microRNA)具有較好的組織特異性，在不同腫瘤中具有特定的表達模式，并在乳腺癌、肝癌、肺癌、腸癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中得到了證實。microRNA能夠游離于細胞外，穩定存在于血漿或血清中，具備疾病分子生物標志物的某些特點。血清microRNA作為腫瘤標志物的研究仍存在許多問題，如血清microRNA所發揮的生物學功能尚未明確，血清和組織microRNA水平的相關性仍存在爭議等。本研究針對上述血清microRNA成為乳腺癌腫瘤標記物進程中兩個最棘手的問題進行分析，以探討其作為乳腺癌早期判斷生物學行為的生物學標志物的可行性和臨床應用價值。本研究對上述問題的闡明，將有助于加快血清microRNA作為腫瘤生物標志物向臨床轉化的應用進程，為腫瘤早期診斷、判斷生物學行為及預后評估提供新思路。本研究尚存在一些不足，如樣本量較少、尚需在大規模樣本研究中證實、僅針對4種microRNA等，在今后研究中，我們將進一步擴大樣本量、擴大研究對象為整個microRNA表達譜、進一步探討microRNA在乳腺癌早期診斷和預后判斷中的價值。

微小RNA(microRNA)通過下調靶基因的表達而參與調節細胞的發育、增殖、分化和凋亡，在人類腫瘤的發生和發展中扮演重要角色[1-3]。microRNA不僅存在于組織細胞中，還豐富而穩定地存在于血清等體液中，腫瘤患者體內循環microRNA的表達譜存在特異性的改變，多項研究顯示了血清microRNA作為腫瘤特異性診斷標志物的潛能，有些更表現出判斷預后的能力，而且血清microRNA易于獲得，早期即可檢測[4]。本研究在前期乳腺癌組織microRNA差異表達譜篩選的基礎上，針對4種表達差異明顯的microRNA(miR-10b、miR-100、miR-155、miR-206)，探討血清microRNA預測乳腺癌早期生物學行為的可行性和臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取天津醫科大學附屬腫瘤醫院2011年3—10月經病理診斷明確的乳腺癌患者165例(乳腺癌組)，均為女性，年齡34～80歲。另選取同時期在我院體檢的健康女性120例為對照組，年齡28～73歲。均為初次確診患者，取血之前未進行手術、放療、化療及內分泌治療。對照組均為未患有惡性腫瘤的年齡與乳腺癌組匹配的健康女性。本研究通過天津醫科大學附屬腫瘤醫院倫理審查委員會審查通過。患者均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集 抽取外周靜脈血6 ml置于不含抗凝劑的管中，靜置30 min，室溫,1 300×g(或4 000 r/min)離心15～20 min，取上層血清分裝至RNAse-free EP管液氮速凍后置于-80 ℃冰箱儲存。

1.2.2 血清樣本總RNA的提取 采用Bioteke公司的血液樣本總RNA快速提取試劑盒提取血清總RNA，血清的起始用量為500 μl，提取過程嚴格按照試劑盒說明書操作。純化后的總RNA樣本經紫外分光光度計進行定量檢測，提取出的總RNA樣本存儲于-80 ℃。

1.2.3 cDNA的合成 使用microRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)對已提取出的總RNA進行逆轉錄，合成cDNA。操作步驟主要包括microRNA 3′末端PolyA加尾處理和PolyA修飾的microRNA逆轉錄反應。

1.2.4 實時定量聚合酶鏈反應(real-time PCR) 應用microRNA莖環引物及PCR引物，內參基因選擇U6，采用SYBR?real-time PCR detection kit熒光定量檢測試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)，利用real time PCR儀(CFX96 real time PCR,德國)進行擴增，并用分析軟件分析PCR結果，從而得出各個microRNA的real-time PCR的CT值并繪制相應的擴增曲線和溶解曲線。樣品目的基因的相對表達率(RQ)采用△CT方法計算[5]。

2 結果

2.1 目標microRNA在前期乳腺癌組織篩查中的表達情況 microRNA篩查及real-time PCR對篩查結果的驗證，共篩選出10種差異性表達的microRNA，以差異表達量>2個fold、CT值<30作為標準，共篩選出4種microRNA，即miR-10b、miR-100、miR-155及miR-206。

2.2 對照組與乳腺癌組microRNA相對表達量比較 對照組與乳腺癌組miR-100、miR-155及miR-206相對表達量比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；兩組miR-10b相對表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表1)。

Table1 Comparison of relative content of microRNA between breast cancer group and control group

組別例數miR-10bmiR-100miR-155miR-206對照組1200 94±0 371 03±0 291 18±0 660 90±0 24乳腺癌組1650 92±0 420 58±0 322 88±1 120 75±0 22t值0 6942 6944 5482 371P值0 4700 0120 0010 010

2.3 乳腺癌患者血清microRNA相對表達量與乳腺癌臨床病理特征間的關系 乳腺癌淋巴結轉移陽性與陰性患者miR-10b相對表達量，不同臨床分期、突變型P53陽性與陰性、Ki-67<14%與≥14%患者miR-155相對表達量和不同分子分型、雌激素受體陽性與陰性患者miR-206相對表達量比較，差異均有統計學意義(P<0.05，見表2)。

3 討論

腫瘤組織microRNA 表達譜與腫瘤發生及預后相關,但是檢測技術復雜、創傷大，且必須在手術之后才能獲得標本，難以真正應用于臨床。2008年Lawrie等首次發現人血清中含有microRNA,緊隨其后，Mitchell等[6]和Chen等[7]幾乎同時報道人血漿或血清中存在穩定的microRNA。相比較而言,外周血血清較易獲得和檢測,臨床應用便捷，易于推廣，血清microRNA一經發現，便引起了研究者的極大興趣。人們發現，microRNA不僅豐富而穩定地存在于血清等體液中，更重要的是其表達水平與疾病密切相關。在疾病狀態下，microRNA表達譜與在組織細胞中一樣，會發生特征性的改變。多項研究顯示了血清microRNA作為腫瘤特異性診斷標志物的潛能，有些更表現出判斷預后的能力，而且血清microRNA易于獲得，早期即可檢測，檢測結果可用來早期預測腫瘤的生物學行為，從而為治療方案的合理選擇提供了參考[8]。

Table2 Relationship between serum expression of microRNA and the clinical and pathological profiles of breast cancer

例數miR-10bmiR-100miR-155miR-206年齡(歲) ≤60860 95±0 670 52±0 362 93±0 620 72±0 28 >60790 90±0 520 54±0 423 12±0 800 74±0 30 U值3133295630523269 P值0 4560 3850 4240 533臨床分期 Ⅰ期400 97±0 560 46±0 302 55±0 890 73±0 43 Ⅱ期831 01±0 610 50±0 192 85±1 060 76±0 26 Ⅲ期421 17±0 450 51±0 433 22±0 920 67±0 22 H值5 3180 96814 2892 091 P值0 0630 6540 0010 352分子分型 LuminalA900 96±0 630 48±0 362 73±1 020 60±0 27 LuminalB181 02±0 490 52±0 202 82±1 160 62±0 21 TNBC221 12±0 500 49±0 373 13±1 200 72±0 30 HER2/neu350 97±0 410 49±0 132 77±1 420 79±0 33 H值4 2021 0633 1216 114 P值0 1200 5880 2540 040組織學分級 Ⅰ級370 91±0 390 51±0 242 90±1 660 71±0 12 Ⅱ級821 10±0 580 53±0 492 68±1 230 69±0 27 Ⅲ級460 93±0 400 57±0 232 80±0 920 74±0 34 H值3 3251 9884 0241 525 P值0 2150 3750 1890 430淋巴結轉移 陽性671 37±0 450 61±0 413 00±0 950 59±0 33 陰性980 75±0 600 57±0 332 83±1 070 82±0 20 U值0311828652518 P值0 0010 5640 1320 062雌激素受體 陽性1080 94±0 560 44±0 323 11±1 120 60±0 34 陰性 57 0 96±0 550 47±0 463 03±0 840 74±0 26 U值3234306829612865 P值0 9200 6920 1200 035孕激素受體 陽性950 98±0 490 52±0 202 97±1 180 64±0 22 陰形700 90±0 570 48±0 372 68±0 920 69±0 46 U值3023316730473195 P值0 4610 5190 4870 540HER2/neu表達 陽性 53 1 03±0 590 55±0 303 16±1 090 76±0 30 陰性1120 92±0 620 48±0 343 02±0 870 69±0 32 U值3232305831053158 P值0 7830 3580 4640 646突變型P53 陽性990 88±0 610 56±0 313 32±0 920 67±0 28 陰性660 93±0 490 58±0 392 34±0 690 59±0 17 U值3094323027902967 P值0 3230 6490 0270 236Ki-67(%) <14 52 1 00±0 380 52±0 292 20±0 810 71±0 32 ≥141131 10±0 500 49±0 313 47±0 760 69±0 28 U值3129306703298 P值0 5330 4240 0010 605

目前推測血清microRNA主要來自于凋亡或壞死的細胞，細胞的主動釋放以及循環細胞的裂解，但對于其真實來源尚不清楚。通過體外檢測血清中microRNA 的表達情況，能否完全代表具有組織特異性的microRNA 在人體腫瘤內部表達的情況，仍存在爭議。本研究在組織芯片篩選的基礎上，對乳腺癌組織中差異性表達的microRNA進行血清學水平檢測，結果表明，目標microRNA在乳腺癌組織和血清中的表達水平具有相關性，這說明乳腺癌患者血清中microRNA的水平可以反映乳腺癌組織中microRNA的表達狀態，這也為血清作為乳腺癌患者組織中microRNA表達水平研究新的便捷標本來源提供了理論基礎。

研究還發現乳腺癌患者血清中microRNA的水平與乳腺癌某些臨床病理特征相關，其中血清miR-10b和miR-206可以分別用來早期預測乳腺癌患者淋巴結轉移狀態和雌激素受體狀態，miR-155可以早期判斷乳腺癌細胞的惡性程度、預測臨床分期。Ma等[9]研究發現miR-10b在轉移性乳腺癌細胞株中的表達明顯升高，如在高轉移能力的MDA-MB-231細胞株中miR-10b表達水平比非轉移性乳腺癌細胞株MCF-7高50倍以上，推測miR-10b在癌細胞的轉移過程中可能起著促進作用。對血清中miR-10b水平的研究發現，血清中miR-10b的水平與淋巴結狀態相關，淋巴結轉移陽性者血清miR-10b水平顯著高于淋巴結轉移陰性者，miR-10b這種表達模式使其可以用來早期預測乳腺癌患者淋巴結轉移狀態，為進一步制定合理的手術方案提供參考。miR-155是最早發現的具有促癌活性的microRNA,研究發現，miR-155通過多種機制參與乳腺癌的發生和發展[10-11]。本研究中血清miR-155與臨床分期、突變型P53的表達以及Ki-67表達指數具有相關性，臨床分期較晚、突變型P53陽性、Ki-67表達指數高的乳腺癌患者血清中miR-155水平更高，這說明miR-155參與了腫瘤細胞增殖、侵襲過程，因此血清中miR-155的水平可以用來早期判斷乳腺癌細胞的惡性程度，同時在早期預測臨床分期、判斷預后方面也有很大的應用價值。乳腺癌細胞系實驗已經證實，miR-206在乳腺癌中的表達水平和雌激素受體的表達呈負相關，雌激素受體陰性的MB-MDA-231細胞系中miR-206的表達水平要高于雌激素陽性的MCF-7細胞系[12]，而且miR-206抑制雌激素受體α而不影響雌激素受體β的表達這種獨特的選擇性作用特點使其很有可能成為一種新的內分泌治療工具。miR-206在雌激素受體陽性的乳腺癌患者血清中下調更加顯著，因此在一定程度上血清中miR-206的水平可以用來早期判斷雌激素受體的狀態，從而進一步預測乳腺癌患者內分泌治療的療效。

在不同類型的腫瘤中，miR-100的表達情況是不同的[13-15]，該指標在乳腺癌中鮮有報道，本研究表明乳腺癌組織血清中miR-100表達顯著下調，這與組織研究結論一致，通過生物信息學的方法，對miR-100的靶基因進行了預測，結果表明miR-100的靶基因作用機制廣泛，包括FGFR3、FOXA1、HOXA1、POSTN、SMAD7、VLDLR等，涉及癌基因、細胞周期、信號通路、細胞耐藥等眾多方面，而這些基因大都參與乳腺癌的發生和進展，miR-100通過對這些基因的調控可能在乳腺癌的發生發展中發揮重要的作用。本研究未發現miR-100與乳腺癌臨床病理特征之間的關聯，miR-100在乳腺癌中的作用機制仍需進一步研究。

綜上所述，血清 microRNA 可以作為乳腺癌的生物標記物來指示腫瘤的臨床病理情況，血清microRNA在乳腺癌早期預測生物學行為、預后評估等方面也有廣闊的應用前景。

作者貢獻：邵營波與張晟對此論文貢獻均等；此課題由邵營波、張晟及張瑾共同設計；研究過程由邵營波、張晟、劉艷及劉晶晶操作完成；研究所用試劑及分析工具由劉晶晶和張霄蓓提供；數據分析由邵營波、張晟及劉艷完成；本論文寫作由邵營波、張晟及張瑾完成。

1 Bartel DP.MicroRNAs: genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2):281-297.

2 Gregory PA,Bracken CP,Bert AG,et al.MicroRNAs as regulators of epithelial-mesenchymal transition[J].Cell Cycle,2008,7(20):3112-3118.

3 Yu Z,Baserga R,Chen L,et al.microRNA,cell cycle,and human breast cancer[J].Am J Pathol,2010,176(3):1058-1064.

4 Gilad S,Meiri E,Yogev Y,et al.Serum microRNAs are promising novel biomarkers[J].PLoS One,2008,3(9):e3148.

5 Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2〔-Delta Delta C(T)〕 Method[J].Methods,2001,25(4):402-408.

6 Mitchell PS,Parkin RK,Kroh EM,et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(30):10513-10518.

7 Chen X,Ba Y,Ma L,et al.Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases[J].Cell Res,2008,18(10):997-1006.

8 Heneghan HM,Miller N,Lowery AJ,et al.Circulating microRNAs as novel minimally invasive biomarkers for breast cancer[J].Ann Surg,2010,251(3):499-505.

9 Ma L,Teruya-Feldstein J,Weinberg RA.Tumour invasion and metastasis initiated by microRNA-10b in breast cancer[J].Nature,2007,449(7163):682-688.

10 Jiang S,Zhang HW,Lu MH,et al.MicroRNA-155 functions as an OncomiR in breast cancer by targeting the suppressor of cytokine signaling 1 gene[J].Cancer Res,2010,70(8):3119-3127.

11 Kong W,He L,Coppola M,et al.MicroRNA-155 regulates cell survival,growth,and chemosensitivity by targeting FOXO3a in breast cancer[J].J Biol Chem,2010,285(23):17869-17879.

12 Kondo N,Toyama T,Sugiura H,et al.miR-206 Expression is down-regulated in estrogen receptor alpha-positive human breast cancer[J].Cancer Res,2008,68(13):5004-5008.

13 Shi W,Alajez NM,Bastianutto C,et al.Significance of Plk1 regulation by miR-100 in human nasopharyngeal cancer[J].Int J Cancer,2010,126(9):2036-2048.

14 Nagaraja AK,Creighton CJ,Yu Z,et al.A link between mir-100 and FRAP1/mTOR in clear cell ovarian cancer[J].Mol Endocrinol,2010,24(2):447-463.

15 Zheng YS,Zhang H,Zhang XJ,et al.MiR-100 regulates cell differentiation and survival by targeting RBSP3,a phosphatase-like tumor suppressor in acute myeloid leukemia[J].Oncogene,2012,31(1):80-92.