不同乳腺癌細胞凍融抗原負載樹突細胞的抑瘤功能研究

曹天澤，高維實，郭慧軍，馬虎林，施曉輝

樹突細胞(DC)是體內最高效能的抗原提呈細胞,在抗腫瘤免疫中處于核心地位[1]。Kjaergaard 等[2]進行的動物模型研究顯示,將DC與各種腫瘤抗原相結合構建DC腫瘤疫苗,可有效抑制腫瘤生長。有研究將進展期腎癌患者自體腎癌細胞裂解，將獲得的腫瘤抗原制備DC疫苗，使患者免疫狀態顯著改善[3-4]。張莉等[5]利用細胞因子大量擴增從宮頸癌患者外周血中獲得的DC，其表面高表達CD86、CD1a、CD83、HLA-DR等表面分子，此DC能將腫瘤抗原有效提呈給T淋巴細胞，從而在體內外誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)對腫瘤細胞的特異性殺傷作用。隨著DC培養技術的發展，DC疫苗已經開始進入臨床。應用何種方式抗原修飾DC產生良好的抑瘤作用是目前研究的一大熱點。本研究分別采用純化培養的乳腺癌細胞、乳腺癌組織及乳腺癌細胞株SKBR-3所制備的凍融抗原分別負載自體外周血來源的DC，比較3種疫苗的抗原活性，為DC疫苗的臨床制備及其應用提供相關的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 純化培養的乳腺癌細胞(A組)、乳腺癌組織(B組)取自我院腫瘤外科乳腺癌手術患者，均經病理核實。乳腺癌細胞株SKBR-3(C組)購自北京協和醫科大學。

1.2 主要試劑 重組人粒細胞-巨細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重組人白介素4(rhIL-4)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)(PEPRO TECH公司)，藻紅蛋白(PE)標記小鼠抗人CD80和CD83熒光單克隆抗體、異硫氰酸(FITC)標記小鼠抗人CD86和HLA-DR熒光單克隆抗體(BD公司)。

1.3 方法

1.3.1 純化培養乳腺癌細胞 無菌條件下獲取新鮮腫瘤組織，將“癌巢”部分銳性粉碎，并將獲得的腫瘤組織分成等質量的兩份(以電子天平稱取精確到0.001 g)，一份置于液氮罐中保存備用。另一份以預熱的膠原酶V進行消化，經洗滌、計數后接種，以選擇性培養基培養，貼壁后去上清及雜細胞，獲得患者自體純化的乳腺癌細胞(見圖1)，以病理細胞學檢測證實。

1.3.2 制備乳腺癌凍融抗原 培養人乳腺癌細胞株SKBR-3。收集1×105的純化培養的乳腺癌細胞及SKBR-3，洗滌后制備凍融抗原，采用Lowry法測定蛋白含量，以牛血清蛋白作為標準。根據測定結果，蛋白濃度調至2 mg/ml,用微孔濾膜(0.22 μm)過濾，-86 ℃保存備用。將液氮保存的乳腺癌組織以研缽研磨、超聲粉碎儀粉碎后，同上法制備抗原。

1.3.3 誘導DC 按本實驗室優化的方法[6]分離外周血的PBMCs，貼壁后去懸浮細胞，完全培養基培養。隔天半換液，維持rhGM-CSF、rhIL-4的終濃度不變，并于第6天在加入TNF-α 30 ng/ml的同時分別加入3組凍融抗原。第7天收獲負載了乳腺癌抗原的成熟DC疫苗(見圖2)。

圖1 純化培養的乳腺癌細胞

圖2 負載抗原的成熟DC疫苗

1.3.4 流式細胞儀分析 用直接熒光標記法標記后，進行流式細胞儀分析。調整DC疫苗的懸液細胞密度至5×105/ml,各取50 μl細胞懸液，分別加入20 μl與其相應的抗體工作液，搖勻、避光，室溫下孵育20 min。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，立即上機檢測。每個樣本數>5×104。獲取樣本中1×104陽性表達率。用同型IgG相應陽性對照。

1.3.5 DC疫苗刺激T淋巴細胞增殖能力的檢測 用尼龍毛法獲取外周血T淋巴細胞,調節T淋巴細胞及3組DC疫苗濃度均為5×104/ml，將3組疫苗分別加入96孔板,按照1∶1比例加入T淋巴細胞，每種比例設6個復孔,靜置培養3 d?；旌吓囵B結束前12 h加入3H-TdR,每孔實際放射比活度為1 μCi，用Beckman液閃計數儀測量CPM值,以空白T細胞孔及空白DMEM培養基孔分別作為對照檢測。

2 結果

2.1 3組的CD80、CD83、CD86和HLA-DR比較 誘導7 d后，3組DC的CD80、CD83、CD86和HLA-DR比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中A、C組與B組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；A組與C組比較，差異均無統計學意義(P>0.05，見表1)。

表1 3組CD80、CD83、CD86和HLA-DR比較

注：與B組比較，*P<0.05

2.2 3組CPM值比較 A組CPM值為(13 047±215)，B組為(4 964±148)，C組為(5 082±176)，3組比較差異有統計學意義(F=5 200.7159，P=0.0000)；其中A組與B、C組比較差異均有統計學意義(q值分別為125.8166和123.9803，P<0.01)；B組與C組比較，差異無統計學意義(q=1.8363，P>0.05)。

3 討論

DC作為最有效、功能最強的抗原遞呈細胞,在腫瘤免疫研究中具有獨特的地位。近年來隨著對DC生物學特性研究的進展，以DC為佐劑的免疫療法已應用在一些惡性腫瘤治療的臨床研究中，取得了令人滿意的療效[7-8]。在體內，DC可直接進入腫瘤區域獲得腫瘤抗原，并向T淋巴細胞呈遞抗原，從而誘發CTL反應。DC作為抗原專職遞呈細胞，其成熟度與其生物學功能密切相關，未成熟的DC具有很強的捕獲、加工處理抗原的能力。而成熟的DC則高表達共刺激分子，具有很強的將腫瘤抗原遞呈給T細胞的能力。腫瘤患者由于缺乏專職抗原遞呈細胞的有效遞呈，導致初始型T細胞與腫瘤細胞的相互作用耐受或無能，阻礙T細胞介導的抗腫瘤免疫有效激活[9]。從目前的研究來看，DC疫苗的抗癌作用是肯定和安全的，但所知的腫瘤特異性抗原很少且無法應用在臨床治療中，而凍融抗原修飾DC具有顯著的治療效果[10]。岳玲玲等[11]也證實在凍融抗原負載DC陽性細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)的實驗中應用低效靶比獲得較好的殺傷效能。因此本研究選用反復凍融法制備全腫瘤細胞抗原致敏DC。腫瘤凍融抗原包括了胞膜和胞內抗原，其特異性低但個體化特點明顯，可誘導機體產生多克隆的CD8+CTL和 CD4+CTL，從而產生較強的抗腫瘤免疫效應。此結果進一步驗證了全抗原融合疫苗體外實驗可顯著增強抗腫瘤免疫效應[12]。

本研究旨在比較不同的凍融抗原所致敏的DC疫苗的抗原活性有無差異。結果顯示，3種不同凍融抗原致敏的DC疫苗在流式細胞表型檢測及T淋巴細胞增殖反應中有顯著差異。細胞株抗原組與純化的腫瘤細胞抗原組均具有較高的細胞表型，但在自體的T淋巴細胞增殖實驗中，純化培養的乳腺癌細胞組表現出較強的抗原活性，在負載DC后，其所介導的抗腫瘤免疫要優于乳腺癌細胞株SKBR-3組，其原因尚未清楚，是否在自體抗原中包括了更多的個體化的、尚未被發現的抗原分子或者是在DC分子表面具有更加嚴格的個體化的抗原受體表位，還有待于進一步研究。

目前，以各種基因、蛋白提取物及某些抗原肽作為佐劑的報道很多，也均在體外實驗中取得了較好的實驗結果。但在體內實驗中，以某一種基因或抗原肽負載DC的腫瘤免疫治療并沒有取得預想的臨床效果，究其原因可能與已知的腫瘤抗原很少、有些腫瘤缺乏特異性抗原、負瘤的機體由于腫瘤內環境所導致的免疫耐受以及機體的免疫呈遞功能低下有關。

Rosenblatt等[13]認為將DC和腫瘤細胞進行融合是刺激機體產生針對腫瘤的CTL反應的有效疫苗，并可誘導機體產生有力的溶瘤作用，就是使腫瘤細胞的全部抗原提呈給DC，繼而激發機體產生特異性抗腫瘤反應。這種方法避免了使用單一抗原或基因等佐劑作為靶抗原的缺點，而是為T淋巴細胞提呈了腫瘤的全套抗原，從而產生更強的免疫應答。

綜上所述，將細胞的全部抗原提呈給DC可以很好地激發機體產生特異性抗腫瘤反應，但是如何更完整地保留腫瘤的全部抗原又以怎樣的方式與DC結合，還有待于進一步研究。

1 Ferrari S,Rovati B,Porta C,et al.Lack of dendritic cell mobilization into the peripheral blood of cancer patients following standard or high-dose chemotherapy plus granulocyte-colony stimulating factor[J].Cancer Immunol Immunother,2003,52(6)：359-366.

2 Kjaergaard J,Shimizu K,Shu S.Electrofusion of syngeneic dendritic cells and tumor generates potent therapeutic vaccine[J].Cell Immunol,2003,225(2)：65-74.

3 Li H,Wang C,Yu J,et al.Dendritic cell-activated cytokine-induced killer cells enhance the anti-tumor effect of chemotherapy on non-small cell lung cancer in patients after surgery[J].Cytotherapy，2009，11(8):1076-1083.

4 Wang Z,Hu Q,Han W,et al.Effect of dendritic cell vaccine against a tongue squamous cell cancer cell line(Tca8113) in vivoand in vitor[J].Int J Oral Maxillofac Surg,2006,35(6):544.

5 張莉，王雪峰.子宮頸癌患者樹突狀細胞體內外誘導抗腫瘤免疫[J].中國全科醫學，2008，12(1)：21-23.

6 曹天澤，高維實，郭慧軍，等.誘導高純度樹突狀細胞的研究[J].內蒙古醫學雜志，2009,41(9):1025-1028.

7 王健，張永澤，潘麗蘭，等.rhHSP70對食管癌細胞RNA轉染的臍血樹突狀細胞誘導CTL抗腫瘤功能的影響[J].疑難病雜志，2011，10(1)：45.

8 元建華，彭大為，李建旺，等.晚期結直腸癌患者樹突細胞聯合細胞因子誘導的殺傷細胞治療效果研究[J].中國全科醫學，2011，14(12)：4139.

9 Mosca PJ,Lyerly HK,Clay TM,et al.Dendritic cell vaccines[J].Front Biosci,2007,12:4050-4060.

10 Lambert LA,Gibson GR,Maloney M,et al.Intranodal immunization with tumor lysate-pulsed dendritic cells enhances protective antitumor immunity[J].Cancer Res,2001,61(2)：641-646.

11 岳玲玲，張連生，柴曄，等.負載抗原的DC與CIK共培養對耐藥乳腺癌細胞的殺傷作用[J].中國腫瘤生物治療雜志,2012，19(4):437-441.

12 張鵬，劉瑞磊，姜華，等.三陰乳腺癌細胞-樹突狀細胞融合疫苗的抗腫瘤免疫效應[J].南方醫科大學學報，2012,32(6):779-783.

13 Rosenblatt J,Vasir B,Uhl L,et al.Vaccination with dendrtic cell/tumor fusing cells results in cellular and homoral antitumor immune reponses in patients with multipul myeloma[J].Blood,2011,117(2):393-402.