攜帶增強綠色熒光蛋白基因的人14-3-3σ真核表達載體的構建及其在轉染乳腺癌MCF-7細胞的表達

郝 苗，齊鳳杰，馬 玲

14-3-3已經被發現是廣泛分布于多種生物體中的一種高度保守的可溶性酸性蛋白家族,在1967年時由Moore 和Perez對牛腦蛋白系統分類時首次發現,共分為7個亞型,有不同的基因編碼[1]。隨著克隆技術的發展及14-3-3 cDNA 文庫的建立,人們對該蛋白的生物學特性及其功能有了較全面且深入的認識。14-3-3 以同源或異源二聚體的形式存在,與多種細胞蛋白等結合并相互作用。14-3-3σ是14-3-3家族中的重要成員，并且是14-3-3家族中惟一能夠被DNA損傷所誘導的成員。大量研究表明，14-3-3σ是細胞周期的負調控因子，它的活化可以使細胞周期停滯于G2/M期，從而抑制細胞的生長。研究發現，14-3-3σ的表達下調能夠使人上皮細胞無限制地增殖[2]，這就說明了14-3-3σ表達的降低有助于腫瘤的形成，促進細胞的無限增殖。14-3-3σ在正常的乳腺上皮細胞呈高表達，而在許多種癌中表達下調，包括乳腺癌、宮頸癌、胃癌。

但是14-3-3σ如何調節腫瘤的發展，14-3-3σ的表達是否與腫瘤的惡性程度相關，目前還不是特別清楚。14-3-3σ在人乳腺癌細胞中的表達下降被認為是乳腺癌發生的一個重要原因之一，所以其可以作為人類乳腺上皮癌變的一個特異性標記[3]。本研究旨在通過構建攜帶增強綠色熒光蛋白基因的14-3-3σ真核表達載體及由脂質體介導轉染至乳腺癌MCF-7細胞,觀察其蛋白轉位,為下一步研究14-3-3σ穩定表達對乳腺癌發展的影響提供實驗工具。

1 材料與方法

1.1 工具酶和試劑 乳腺癌MCF-7細胞,胎牛血清(杭州四季青),1640培養基(GIBCO公司),DNAmarker、內切酶BamH I、HindⅢ、聚合酶鏈反應(PCR)產物回收試劑盒、質粒大量提取試劑盒、質粒小量提取試劑盒(TaKaRa公司),脂質體2000和G418(GIBICO公司),小鼠抗人14-3-3σ單克隆抗體、β-actin一抗(Santa Crut公司),磷酸鹽緩沖液(PBS)、TBE緩沖液、LB培養基(實驗室自配)，攜帶增強綠色熒光重組真核表達質粒pEGFP-GV418(上海吉凱基因化學技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 引物設計及總RNA的提取 根據GenBank 中已經發表的mRNA 序列(登錄號：NM011740)設計帶酶切位點的人14-3-3 基因的逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)引物。正向引物為：5′-CGAATTCCCATGGAGAGAGCCAGTCTGA-3′(下劃線部分為BamH Ⅰ限制性核酸內切酶位點)，反向引物為：5′-GGGGATCCCAGCTCTGGGGCTCCTGG-3′(下劃線部分為HindⅢ限制性核酸內切酶位點)。引物合成委托上海吉凱基因化學技術有限公司完成。總RNA的提取與RT-PCR：從HeLa細胞中提取總RNA。按照反轉錄酶TaKaRa公司的說明書進行RT-PCR擴增獲得編碼14-3-3 的cDNA序列，PCR擴增反應體系如下：12.5 μl的2 ×GC buferI、2.5 μl dNTP、正義鏈/反義鏈引物(20 μmol/L)各1.25 μl、cDNA模板1 μl、PyrobestDNA polymerase 0.15 μl、加去離子水至25 μl。擴增反應條件：94 ℃預變性5 rain，94 ℃變性45 s，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，反應30個循環，72 ℃延伸10 min，PCR產物命名為SFN，長度747 bp。擴增產物經20 g/L瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.2.2 克隆載體pCUm-GV142-SFN的構建、鑒定和序列測定 用BamHⅠ和HindⅢ 酶切備用的PCR 產物,膠回收純化后與同樣酶切的pEGFP-N1真核表達質粒在T4連接酶作用下16 ℃過夜連接。連接產物轉化DH5a后,取足量菌體涂布于含氨芐西林的LB平板,37 ℃過夜培養。隔日,挑取數個陽性菌落于含氨芐西林的LB培養液中,50 ml搖菌管37 ℃振搖過夜,質粒小抽。用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切和PCR初步鑒定陽性細菌克隆。將酶切鑒定和PCR正確的細菌克隆所得質粒經酶切后以1% 的瓊脂糖電泳初步分析及酶切鑒定后,送上海吉凱基因化學技術有限公司測序。測序正確的質粒經大量擴增后,用去內毒素質粒抽提試劑盒提取質粒,定量后用于細胞轉染。

1.2.3 建立穩定轉染乳腺癌MCF-7細胞系 乳腺癌MCF-7細胞在含10 %(體積分數)胎牛血清、青霉素、鏈霉素的1640培養基中,于37 ℃、5 %(體積分數)二氧化碳(CO2)的飽和濕度下培養。待細胞融合至70%～80%時按照LipofectamineTM2000 操作說明書進行空質粒pEGFP-N1 和重組表達載體pCUm-GV142-SFN 的轉染。在24孔培養板上,以無血清無雙抗的1640培養基培養4 h后進行轉染步驟：(1)按影響轉染效率的鋪板密度(1×104/孔、2×104/孔和4×104/孔)；(2)鋪板密度為2×104/孔,固定質粒用量1 μg,作用時間4 h,使用不同量的LipofectamineTM2000轉染(1、2、3、5、8和10 μl)；(3)孵育時間;鋪板密度為2×104/孔,質粒用量0.5 μg,脂質體用量4 μl,使用不同的孵育時間(2、4、6和8 h),逐一優化轉染條件轉染，4 h后換成完全培養基。轉染后48 h,熒光顯微鏡觀察熒光蛋白表達。用胰蛋白酶消化細胞，在含有G418(700 μg/ml) 的選擇性培養基中加壓篩選6 周,獲得具有抗生素抗性的陽性細胞克隆,擴增培養即為穩定表達14-3-3σ的乳腺癌MCF-7細胞系,命名為MCF-7GV142細胞。

1.2.4 Western blot法檢測14-3-3σ表達 轉染48 h收集細胞,裂解后提取總蛋白，取20 μg 處理后的蛋白樣品，用BCA蛋白定量試劑盒定量后進行12%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，半干法轉移至PVDF 膜上,50 g/L脫脂奶粉室溫振蕩封閉1 h,與1∶200 稀釋后的一抗(鼠抗人14-3-3 單克隆抗體，鼠抗人B-Aetin單克隆抗體)4 ℃孵育過夜,磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗膜3次,10 min/次,然后與1∶5 000 稀釋后的HRP標記的羊抗鼠二抗室溫孵育2 h,PBST 洗膜3次,10 min/次，最后采用增強化學發光法檢測目的蛋白。

2 結果

2.1 特異性條帶的獲得 提取HeLa細胞總RNA，RT-PCR 產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離后得到一條大約800 bp位置的特異條帶,與14-3-3 cDNA 的大小完全一致(見圖1)。

注：M：Marker，1：14-3-3σ RT-PCR擴增產物

圖1 人14-3-3σ RT-PCR擴增產物的鑒定

Figure1 Identification of PCR amplified products of 14-3-3 σ

2.2 真核表達載體pCMV-GV142-SFN的構建及鑒定 重組質粒pCMV-GV142-SFN用限制性內切酶BamHⅠ和HindⅢ雙酶切,得到一條774 bp的目的條帶(見圖2)。證明目的基因已正確插入質粒GV142,得到了真核表達載體pCMV-GV142-SFN。

圖2 酶切鑒定

2.3 DNA序列分析 所獲質粒經上海生工生物工程技術服務有限公司測序并與GenBank公布的序(NM_006142.3)比對,同源性100%,無堿基突變(見圖3)。

2.4 建立穩定轉染乳腺癌MCF-7細胞 據優化后的轉染條件,將攜帶GV142的真核表達質粒轉入乳腺癌MCF-7靶細胞,熒光顯微鏡下觀察發現：轉染24 h后,乳腺癌MCF-7細胞內可見增強綠色熒光蛋白表達,48 h表達最穩定,72 h可見熒光蛋白淬滅,細胞形態逐漸消失(見圖4)。

2.5 Western blot 檢測結果 乳腺癌MCF-7細胞克隆中GV142蛋白表達，所構建的真核表達載體已在乳腺癌MCF-7細胞內表達(見圖5)。

圖3 測序鑒定圖

A：轉染24 h后,乳腺癌MCF-7細胞內可見增強綠色熒光蛋白表達,B：48 h表達最穩定,C：72 h可見熒光蛋白淬滅

圖4 熒光顯微鏡觀察所示

Figure4 Results by fluorescence microscope

注：A未轉染乳腺癌細胞，B轉染陰性乳腺癌細胞，C轉染陽性乳腺癌細胞

圖5 Western blot 檢測結果

Figure5 Western blot test results

3 討論

14-3-3通過與其他數百種磷酸化或非磷酸化蛋白結合而發揮其獨特的作用。14-3-3σ是14-3-3家族中的重要一種，因能特異地表達于上皮細胞，故被稱為人類上皮細胞標志物[4]。作為細胞周期檢查點的基因家族成員，負責DNA的損傷修復。在正常細胞周期信號通路傳導路徑中起著重要效用[5]。在細胞周期中，14-3-3σ位于抑癌基因p53的上游，二者起正性調節作用。其產物可與多種信號蛋白包括磷酸酶、激酶或跨膜蛋白等相互作用[6]，在細胞周期調控、信號轉導、細胞分化、細胞增殖、死亡及遷移中發揮重要作用，有文獻報道14-3-3 受到多種轉錄因子的直接調控，通過以下3種可能途徑影響轉錄因子發揮作用：(1)14-3-3σ與轉錄因子相螯合影響了轉錄因子與下游基因的DNA結合；(2)14-3-3σ與轉錄因子相螯合影響了轉錄因子自身的蛋白水解；(3)14-3-3σ與轉錄因子相螯合影響了轉錄因子與其他蛋白的相互作用[7-9]。目前，國內未見人源性14-3-3σ真核表達載體在乳腺癌中作用機制的相關研究[10]。本研究從HeLa細胞總RNA中獲得編碼14-3-3σ的cDNA，將其克隆入pEGFP-N1載體，構建了人源性14-3-3σ真核表達載體pCMV-GV142-SFN。通過脂質體介導的方法將pCMV-GV142-SFN載體轉染HeLa細胞后，Western blot證實轉染細胞內14-3-3σ的表達明顯增高。這為研究14-3-3σ的功能提供了必要條件，為以后進一步研究14-3-3σ與乳腺癌的發生、發展的關系以及14-3-3σ與轉錄因子相互作用在乳腺癌發生、發展中的機制研究奠定了實驗基礎。

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