凋亡相關蛋白在慢性應激抑郁模型大鼠海馬神經元的表達及碳酸鋰的影響

孔令韜，胡 賢，吳 楓，湯艷清

名詞解釋開場試驗：開場試驗是通過測量動物進入開闊環境后的各種行為，來觀察研究動物神經精神變化情況，被廣泛應用于動物行為學、腦功能及藥物對動物行為影響等方面的研究。在開場試驗箱中，試驗箱場地被劃分成數個固定大小的開場格，動物被放入箱內后由于對新環境的恐懼和其探究本性會在箱中不斷活動和探索，可以通過對其相關行為的評估來評價動物抑郁或焦慮情緒。

抑郁癥是以心境低落、思維遲緩、認知功能損害、意志活動減退和軀體癥狀為主要臨床表現的常見精神疾病[1]。盡管近年來抑郁癥在治療方面已經取得了很大進展，但是對抑郁癥發病的生物學基礎及抗抑郁藥物起效的具體機制等仍不清楚。應激性生活事件被認為是導致抑郁癥發病的高風險因素[2]，海馬作為介導應激反應的重要腦區，發現其在抑郁癥患者中存在結構和功能上異常[3-4]。有研究表明，抑郁癥患者存在海馬神經元體積和密度的降低[5]，認為可能與應激導致的海馬神經元損傷和凋亡增加有關[6]。近年來，碳酸鋰作為抗抑郁藥物的增效劑被應用于難治性抑郁癥的治療并取得良好效果，但其作用的分子機制仍不十分清楚。有研究認為，碳酸鋰可能通過上調中樞神經系統中抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)的表達發揮其抗抑郁作用[7]。本研究擬進一步觀察與凋亡密切相關的兩種蛋白Bcl-2和細胞色素C在慢性應激性抑郁模型大鼠海馬中的表達及碳酸鋰對其影響，探討海馬神經元凋亡在抑郁癥發病機制中的作用及抗抑郁藥物的部分作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 普通級青年雄性Wistar大鼠45只，2～3月齡，體質量180～220 g，健康狀況良好，由中國醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：SYXK(遼)2003-0013。飼養條件：自由飲食水，光暗周期為12/12 h,實驗前適應性飼養1周。用隨機排列表法分為3組(每組15只)：正常對照組、抑郁模型組和碳酸鋰組。

1.1.2 主要試劑 小鼠抗大鼠Bcl-2抗體(Santa Cruz Co.)，兔抗大鼠細胞色素C抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，生物素標記的兔抗小鼠IgG，山羊抗兔IgG，ECL試劑盒(Santa Cruz Co.)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 入組后第1～21天，對照組大鼠正常飼養；模型組和碳酸鋰組大鼠隨機接受7種不同的刺激：電擊足底(30～40 V,20 s/次，間隔1 min，共20次)；強迫游泳(水溫20 ℃,5 min)；夾尾(1 min)；搖晃(水平往復，1次/s，共15 min)；熱應激(45 ℃溫箱，5 min)；禁食(48 h)；禁水(24 h)。每天隨機給予一種刺激，每種刺激累計使用2～3次[8]。

1.2.2 行為學指標觀察 制備模型前后，對各組動物進行開場試驗測定大鼠5 min 內的行為表現，包括水平穿越格數、豎立次數、修飾次數等。制備模型前后，對各組大鼠進行液體消耗實驗，計算24 h 內蔗糖水消耗百分比(糖水消耗/總液體消耗×100%)。

1.2.3 藥物干預 將碳酸鋰片劑(250 mg/片)研磨成粉，溶于蒸餾水。第1～21天，每天應激前，碳酸鋰組灌胃碳酸鋰60 mg/kg，模型組和對照組灌胃等體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.2.4 腦組織處理及Western-blot法測定海馬Bcl-2和細胞色素C的表達 第22天，將大鼠斷頭處死，迅速取腦剝離海馬組織，置于4 ℃環境中，加入300 μl裂解液勻漿并離心1 h，吸取上清液，進行免疫印跡測定。具體步驟如下：考馬斯亮藍G250法測定蛋白濃度后加入樣品緩沖液調節樣品蛋白濃度；灌膠，加樣，電泳，轉膜，于5%脫脂奶粉封閉液中4 ℃過夜；分別加入Bcl-2抗體(1∶200)或細胞色素C抗體(1∶200)，搖床上室溫孵育2 h；加入按1∶400稀釋的辣根過氧化物酶結合的IgG，搖床上室溫孵育2 h；ECL法顯色；曝光，顯影，定影。Western blot法測定結果用Chemi Imager 5500 V2.03軟件掃描，再用Fluor Chen2.0軟件定量分析測得整合光密度值(IDV)。

2 結果

2.1 各組大鼠慢性應激前后行為學指標的比較 慢性應激前3組大鼠的水平穿越格數、豎立次數、修飾次數和糖水消耗百分比比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。慢性應激21 d后，3組大鼠的水平穿越格數、豎立次數、修飾次數和糖水消耗百分比比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其中模型組和碳酸鋰組水平穿越格數、豎立次數、修飾次數、糖水消耗百分比均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；碳酸鋰組的水平穿越格數、豎立次數、修飾次數及糖水消耗百分比與模型組比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表1)。

2.2 Western-blot法測定海馬Bcl-2和細胞色素C表達 慢性應激后3組大鼠海馬Bcl-2和細胞色素C的表達水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。其中模型組大鼠海馬Bcl-2的表達水平低于對照組，細胞色素C的表達水平高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.01)；碳酸鋰組大鼠海馬細胞色素C的表達水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，而Bcl-2的表達水平與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；碳酸鋰組大鼠海馬Bcl-2的表達水平高于模型組，細胞色素C的表達水平低于模型組，差異均有統計學意義(P<0.01，見表2)。

表1 3組大鼠慢性應激前后開場試驗行為及糖水消耗比較

注：與對照組比較，△P<0.05

Table2 Comparison of expression of Bcl-2 and cytochrome C among 3 groups

組別數量Bcl-2(IDV值)細胞色素C(IDV值)對照組1544339±3424 24631±2194 模型組1536162±5332?38963±5384? 碳酸鋰組1542605±5409△34377±3840?△F值12 03349 649P值<0 05<0 05

注：與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.01

3 討論

慢性不可預見性應激(CUMS)抑郁模型[8]采用輕度、不可預見的應激因子模擬人類生活事件和環境應激刺激等心理社會因素，其理論依據與人類抑郁癥中慢性、低水平的應激源促進疾病發生、加速疾病發展的機制更接近，是近年來國內外廣泛應用的探討抑郁癥發病機制及抗抑郁藥物藥理學作用的動物模型之一。本研究中，模型組大鼠經過21 d慢性綜合應激，與對照組相比活動能力降低、探究行為減少、修飾次數減少以及糖水消耗百分比下降，這些表現與臨床抑郁癥患者所表現的精神運動改變、興趣或快感的喪失有很大程度的相似性，以上結果說明本研究中大鼠抑郁癥模型的制作是成功的[9]。

凋亡是維持體內細胞動態平衡的一種基本現象，是成年生物體內清除病變和衰老細胞，保持機體健康和內環境平衡的重要生物過程。Bcl-2是細胞內重要的抗凋亡蛋白之一，主要存在于線粒體外膜上，在正常細胞中起到抑制線粒體內細胞色素C等促凋亡蛋白釋放，防止凋亡發生的作用。當細胞遭受應激反應或凋亡信號刺激后，細胞質內的促凋亡蛋白被激活并與Bcl-2結合使其喪失對細胞凋亡的抑制作用，導致線粒體內的細胞色素C被釋放到細胞質中，細胞色素C的釋放能夠激活內源性細胞凋亡途徑并最終導致細胞凋亡[10]。既往已有Lucassen等[11]研究發現慢性應激可能導致海馬神經元凋亡增加，而本研究結果表明，在慢性應激導致的抑郁癥模型中，模型組大鼠海馬Bcl-2表達較對照組降低，細胞色素C表達較對照組增加，表明長時間的慢性應激可能激活海馬神經元內促凋亡蛋白與Bcl-2的結合，導致Bcl-2表達減少及線粒體內細胞色素C釋放的增多，這可能是慢性應激導致海馬神經元凋亡及海馬功能損害的內在途徑之一。

碳酸鋰是治療急性雙相抑郁障礙的一線藥物，同時也被作為抗抑郁藥物的增效劑用于單相抑郁發作的治療，能夠增強抗抑郁藥物的治療效果[12]。本研究中，碳酸鋰組大鼠行為學表現優于模型組大鼠，提示碳酸鋰能夠有效改善慢性應激導致的大鼠抑郁行為。有研究報道碳酸鋰可以提高正常大鼠海馬Bcl-2的表達，認為這可能與碳酸鋰抗抑郁作用有關[13]。本研究結果表明，碳酸鋰能夠提高慢性應激性抑郁模型大鼠海馬Bcl-2的表達，同時降低細胞色素C的表達，提示碳酸鋰可能通過參與對凋亡途徑中相關蛋白表達的調控來減少應激導致的神經元凋亡，這種神經元保護作用可能是碳酸鋰發揮其抗抑郁作用的藥理學機制之一。但是我們也注意到，在對凋亡相關蛋白的調控中，碳酸鋰對Bcl-2的影響要強于對細胞色素C的影響，這意味著盡管碳酸鋰對凋亡上游抗凋亡蛋白的表達有很好的上調作用，但仍無法完全抑制神經元凋亡過程的發生。這可能與細胞凋亡過程調控的復雜性有關：除了Bcl-2之外，細胞內其他凋亡相關蛋白如Bcl-xl、Bax等也都參與了對細胞凋亡的調控[14-15]，而碳酸鋰對他們的影響尚不清楚，這也可能是導致碳酸鋰不能完全改善慢性應激導致的大鼠行為改變的原因之一。

綜上所述，本研究認為慢性應激導致海馬神經元凋亡相關蛋白表達的變化可能是抑郁癥發病的內在機制之一，碳酸鋰對相關蛋白的調控可能是其發揮抗抑郁療效的靶點之一，但由于細胞凋亡的過程比較復雜，參與對細胞凋亡調控的蛋白種類較多，凋亡與抑郁癥發病及治療的關系仍有待于今后的進一步研究。

來自本文更多的信息

(1)作者貢獻：此課題由孔令韜和吳楓共同設計；研究過程由孔令韜、胡賢及吳楓操作完成；研究所用新試劑及分析工具由湯艷清提供；數據分析由孔令韜完成；本論文寫作由孔令韜及吳楓完成。

(2)作者聲明：文章為原始作品，數據準確，內容不涉及泄密，無一稿兩投，無抄襲，無內容剽竊，無作者署名爭議，無與他人課題及專利技術的爭執。內容真實，文責自負。

(3)利益沖突：課題未涉及任何廠家及其他經濟組織直接或間接的經濟或利益的贊助。

(4)倫理要求：實驗過程中對動物的處置符合中國醫科大學倫理委員會相關動物倫理學標準。

(5)研究的背景資料：海馬神經元損害和凋亡與抑郁癥的發病密切相關，抗抑郁藥物可能通過抑制相關神經元凋亡來發揮作用。

(6)文章要點：用慢性不可預見性應激方法建立大鼠抑郁模型并在造模過程中給予碳酸鋰治療，用Western-blot法測定大鼠海馬中凋亡相關蛋白Bcl-2和細胞色素C的表達情況及碳酸鋰對其影響。

(7)研究的創新之處與不足：創新之處：探討碳酸鋰作為抗抑郁藥物的增效劑在抑制海馬神經元凋亡過程中的作用機制。不足：樣本數較少，觀察時間較短。

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