自發性高血壓大鼠血清脂聯素和心肌脂聯素受體1的表達及胰島素抵抗程度與心室重構的關系研究

孫 蕊，劉雅娟，孫紅茜，秦 毅，楊銳英

高血壓(EH)是一種嚴重危害人類健康的常見病、多發病，而左心室肥厚和擴大是EH心室重構的主要表現。脂聯素(APN)是由白色脂肪細胞分泌的一種細胞因子，可以與心肌組織上分布的APN受體結合，發揮其增敏胰島素、預防心肌細胞肥大、抗動脈粥樣硬化等作用[1-2]。本研究旨在觀察自發性高血壓大鼠(SHR)血清APN及心肌脂聯素受體1(AdipoR1)的表達，探討APN及其受體與EH及EH心室重構之間的關系，為APN預防或延緩EH以及其靶器官損害的發生、發展提供理論依據。

1 動物與方法

1.1 實驗動物 22周齡雄性SHR大鼠(SHR組)及其同系正常對照Wistar-Kyoto(WKY)大鼠(WKY組)各8只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證編號SCXK(京)2012-0001。普通光照環境中飼養，自由進食水。

1.2 標本收集 處死動物前1 d禁食水12 h，電子秤稱體質量(BW)，采用北京軟隆公司BP-98A智能無創血壓計測量尾動脈收縮壓(SBP)。次日清晨，尾尖采血測定空腹血糖(FBG)。腹腔注射10%水合氯醛以麻醉大鼠，迅速開胸，由腹主動脈穿刺取血5 ml，2 h內以3 000 r/min離心10 min，分離血清。迅速取出心臟，稱全心重量(HW)；保留大鼠左心室游離壁和室間隔作為左心室重量(LVW)。取部分心肌組織，置于4%多聚甲醛中固定，以備做組織形態學檢查，剩余組織立即轉存于-80 ℃冰箱，用以做實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)檢測。

1.3 指標測定

1.3.1 生化指標測定 FBG測定，采用強生One Touch Ultra系列血糖儀測定；空腹胰島素(FINS)測定，采用放射免疫法，試劑盒購于北京原子高科股份有限公司；計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR)=(FBG×FINS)/22.5。

1.3.2 心室肥厚指標測定 計算心臟重量指數(HWI)和左心室重量指數(LVWI)，HWI=HW/BW，LVWI=LVW/BW，以HWI和LVWI作為判斷心室肥厚的指標。

1.3.3 心肌組織形態學觀察 將固定好的心肌組織標本進行石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察心肌細胞形態。

1.3.4 血清學指標測定 血清APN測定采用酶聯免疫法，試劑盒購于美國R&D公司。

1.3.5 免疫組織化學法檢測心肌AdipoR1分布及蛋白表達 將心肌組織石蠟切片在二甲苯及降序梯度乙醇溶液中常規脫蠟至水，過氧化氫(H2O2)滅活內源性過氧化物酶，然后用兔血清封閉液封閉，加AdipoR1單克隆抗體(購于美國Abcam公司)及生物素化二抗，用DAB顯色劑顯色。免疫組化法結果判定：心肌AdipoR1陽性顯色為棕黃色，在400倍物鏡下，用醫學圖像分析系統進行數據分析，每張切片檢測10個視野，以平均積分光密度值代表蛋白相對量。

1.3.6 實時熒光定量PCR 檢測心肌AdipoR1 mRNA表達 在NCBI GenBank數據庫中查詢AdipoR1(NM_207587.1)，采用Primer Premier 5.0軟件設計引物。目的基因及引物序列見表1。

用美國AXYGEN公司RNA提取試劑盒提取標本總RNA，測定總RNA濃度，以OD260/OD280在1.8～2.0的RNA做后續實驗。用北京全式金公司逆轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA。取1 μl逆轉錄產物，按北京全式金公司熒光定量PCR試劑盒說明，以25 μl體系，按以下條件進行PCR：95 ℃預變性10 min，94 ℃變性15 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延長30 s，擴增40個循環。通過實時熒光定量PCR儀進行分析。根據目的基因的相對量=2-△△Ct計算結果，△△Ct=〔CtGI(待測樣本)-CtGAPDH(待測樣本)〕-〔CtGI(校正樣本)-CtGAPDH(校正樣本)〕。

表1 目的基因及引物序列

2 結果

2.1 一般情況 與同周齡WKY組相比，SHR組BW減低，SBP、HW、LVW、HWI、LVWI、FINS及HOMA-IR增高，差異均有統計學意義(P<0.05);兩組FBG差異無統計學意義(P>0.05，見表2)。

2.2 心肌細胞形態學觀察 在光鏡下可見，WKY組心肌纖維走行較規整，細胞核呈圓形，間質及微血管形態正常。而SHR組心肌纖維走行紊亂，心肌細胞存在不同程度的變性，細胞間界限不清，細胞核增大，心肌細胞間質成纖維細胞增生，見圖1。

2.3 血清APN表達 與WKY組相比，SHR組血清APN表達降低，差異有統計學意義(P<0.05，見表3)。

2.4 心肌AdipoR1分布及蛋白表達 心肌AdipoR1陽性染色結果呈棕黃色顆粒，主要分布于心肌細胞膜和細胞質。SHR組心肌AdipoR1陽性染色減少，與WKY組比較差異有統計學意義(P<0.05，見表3、圖2)。

2.5 心肌AdipoR1 mRNA表達 SHR組心肌AdipoR1 mRNA表達低于WKY組，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05，見表3、圖3)。

2.6 大鼠SBP與各指標的相關性及危險因素分析 Pearson直線相關顯示，大鼠SBP與血清APN、AdipoR1、AdipoR1 mRNA呈負相關，與HWI、LVWI、HOMA-IR呈正相關，見表4；以SBP為因變量，以上述測量指標為自變量進行多元線性逐步回歸分析顯示，血清APN和HOMA-IR是大鼠SBP的影響因素，見表5。

表2 兩組大鼠一般情況比較

注：SBP=收縮壓，BW=體質量，HW=全心重量，LVW=左心室重量，HWI=全心重量指數，LVWI=左心室重量指數，FBG=空腹血糖，FINS=空腹胰島素，HOMA-IR=胰島素抵抗指數;HWI=HW/BW，LVWI=LVW/BW，HOMA-IR=(FBG×FINS)/22.5

Table3 Expression of serum APN and myocardial AdipoR1 between two groups

檢測指標WKY組SHR組t值P值血清APN(mg/L)8 74±0 514 32±0 3819 5860 000AdipoR10 66±0 040 20±0 0225 8130 000AdipoR1mRNA0 89±0 060 14±0 0624 8100 000

注：APN=脂聯素

表4 SBP與各指標的直線相關關系

表5 SBP與各指標多元線性逐步回歸分析結果

Table5 Multivariate linear stepwise regression analysis result between SBP and each index

變量bβt值P值常數項 210 489 - 9 9810 000APN-11 139-0 663-6 0720 000HOMA-IR 8 869 0 323 2 9550 006

2.7 大鼠LVWI與各指標的相關性及危險因素分析 Pearson直線相關顯示，大鼠LVWI與血清APN、AdipoR1、AdipoR1 mRNA呈負相關，與SBP、HWI、HOMA-IR呈正相關，見表6；以LVWI為應變量，以上述測量指標為自變量進行多元線性逐步回歸分析顯示，心肌AdipoR1、心肌AdipoR1 mRNA、HWI、SBP是大鼠LVWI的影響因素，見表7。

表6 LVWI與各指標的直線相關關系

表7 LVWI與各指標多元線性逐步回歸分析結果

Table7 Multivariate linear stepwise regression analysis result between LVWI and each index

變量bβt值P值常數項 1 455- 3 4810 000AdipoR1-0 300-0 293-2 1580 027AdipoR1mRNA-0 302-0 242-1 8170 032HWI 0 374 0 434 4 2980 000SBP 0 001 0 042 0 3300 004

圖1 兩組大鼠心肌細胞HE染色(SP×400)

圖2 心肌AdipoR1的表達(SP×400)

圖3 心肌AdipoR1熒光定量PCR擴增曲線

Figure3 Amplification plot of myocardium AdipoR1 fluorescent quantitation PCR

3 討論

3.1 SHR的基本特性 本研究結果顯示，與WKY組相比，SHR組SBP水平均可達180 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)以上、HOMA-IR增大，HWI及LVWI增加，心肌纖維走行紊亂、心肌細胞增生肥大。提示：22周齡SHR SBP升高并相對穩定，同時伴有胰島素抵抗(IR)，本研究高血壓模型選擇成功；22周齡SHR已出現心肌肥厚和心肌間質纖維化，發生了心室重構。

SHR因其發病機制、EH心血管并發癥等都與人類EH患者相似，是目前國際公認最接近于人類EH的動物模型，被廣泛應用于醫學基礎實驗研究中。有研究表明，SHR大鼠4～6周時SBP開始升高，6個月左右SBP上升到最高水平并趨于穩定，可出現EH中后期靶器官損害的特征性表現，如心肌肥大、心力衰竭、腎功能不全等[3]。本研究結果同樣證實該模型的以上生理學特征。有研究表明，EH患者中約半數存在IR現象，而動物實驗同樣發現，SHR存在明顯IR和高胰島素血癥[4]，這與本研究結果一致。本研究對大鼠SBP相關因素進行多元逐步回歸分析后發現，HOMA-IR是影響SBP的重要因素。作為EH的重要發病機制之一，IR可能通過以下途徑促使血壓升高：(1)使電解質代謝發生障礙，Na+-K+ATP酶激活使細胞內鈉增加，導致鈉潴留；(2)使血管對體內升壓物質反應增強，影響血管舒張功能。目前EH心臟重構機制尚不十分清楚，多數觀點認為：(l)血流動力學負荷過重，即機械應力增加是引起心臟肥大的主要原因；(2)神經內分泌因子激活和釋放，主要是交感神經激活釋放兒茶酚胺、腎素血管緊張素系統(RAS)激活產生腎素、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和醛固酮，以及其他神經內分泌因素如內皮素、心房尿鈉肽、緩激肽、前列腺素等。近年發現，一種新的脂肪因子APN也與EH心室重構發生、發展有密切關系。

3.2 APN表達水平與EH的關系 本研究結果顯示，與WKY組相比，SHR組血清APN水平下降，心肌AdipoR1及AdipoR1 mRNA表達降低，表明SHR存在低APN血癥。Adamczak等[5]報道，EH患者較正常對照者血漿APN水平明顯降低，認為APN可能在EH的發病中起一定作用。Iwashima等[6]研究了446例EH患者和312例血壓正常者，同樣發現EH組血漿APN水平明顯降低，經校正年齡、體質指數(BMI)及總膽固醇等影響因素后，EH組較血壓正常組血漿APN水平仍明顯降低。動物實驗同樣發現，SHR血清APN濃度降低且AdipoR1在SHR大鼠心臟的表達降低[7]，以上結果與本研究一致。然而亦有不同結論，Mallamaci等[8]則認為，中年男性EH患者血漿APN明顯升高，同時肌酐清除率比正常對照組低。造成這種異同結論的原因可能為在EH初期APN水平降低，但當EH后期出現靶器官損害時，腎功能受損，腎臟對APN的清除率下降，APN水平升高。

本研究結果顯示，大鼠SBP與血清APN、心肌AdipoR1、心肌AdipoR1 mRNA呈負相關，對大鼠SBP相關因素進行多元逐步回歸分析后發現，血清APN是影響SBP的重要因素。目前APN水平的高低與血壓的相關性仍有爭議。但近年多數學者的觀點認為，血壓水平與APN呈負相關[9]，低脂聯素血癥是EH重要的獨立預測因子[10]，該結論與本研究結果一致。目前支持EH與APN存在相關性的學者認為APN與血壓呈負相關的可能機制為：(1)低脂聯素血癥可加重血管內皮的炎癥反應和血管平滑肌細胞的增殖和遷移，使血管阻力增高，血壓升高[11-12]；(2)低脂聯素血癥與兒茶酚胺水平的增高可能存在某種聯系，使交感神經活性亢進，血壓增高[13]；(3)低脂聯素血癥使機體糖脂代謝失衡，IR加重，繼發性高胰島素血癥使腎臟水鈉重吸收增強，血壓升高[6]；(4)低脂聯素血癥誘發脂肪組織中RAS活化，AngⅡ抑制脂肪細胞分化，促使三酰甘油在細胞內聚集，細胞體積變大，導致脂肪含量增加，脂肪組織中RAS組分增加，血壓升高[14]；(5)低脂聯素血癥可能在尚無IR 的早期階段即參與 EH 的發生、發展[6]。由此可見，APN在EH發病過程中發揮著重要的作用，將有利于評估EH患病風險及療效，并為臨床EH的有效預防和進一步治療提供重要的理論指導和新的更有效的途徑。

3.3 血清APN、心肌AdipoR1與心室重構的關系 本研究結果顯示，大鼠LVWI與血清APN、心肌AdipoR1呈負相關；對大鼠LVWI相關因素進行多元逐步回歸分析后發現，心肌AdipoR1是影響左心室重構的獨立危險因素。

近年來發現，APN水平的下降和左心室心肌肥大而引發的舒張功能不全密切相關。Kozakova等[15]在正常人群中研究發現循環中APN獨立于年齡和代謝因素與左心室體積和室壁厚度具有負相關性。Koichi等[16]在APN基因敲除的小鼠和過氧化物酶體增殖物激活受體-α(PPAR-α)基因敲除的小鼠研究中發現，APN可通過激活依賴腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的PPAR-α而起到抑制AngⅡ誘導的心肌纖維化，抑制心臟重構。目前認為，APN對心肌具有保護作用，而這種保護作用主要依賴于與心肌中的AdipoR結合來發揮。實驗表明心室肌細胞既可以分泌APN，又有 AdipoR1/2的表達，在結扎冠狀動脈左前降支所致心肌缺血的小鼠模型中，梗死區和梗死邊緣區左心室肌 AdipoR1 mRNA 和蛋白表達均明顯降低[17]；而AdipoR2表達無明顯變化。但AdipoR在EH心肌重構中作用機制尚不明確。有研究發現，AdipoR的下游主要涉及AMPK、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和PPAR-α等多個細胞內信號分子，AMPK 作為一種能量及氧化應激敏感性的蛋白激酶，是APN信號轉導通路中的關鍵信號分子[18]。有學者認為，APN通過與心肌AdipoR1結合后促進AMPK磷酸化，進而活化其下游信號分子乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、p38MAPK 和PPAR-α，從而促進葡萄糖攝取和脂肪酸氧化，為心肌細胞供應能量[19]，并抑制心肌肥厚。因此，筆者推測血清APN和心肌AdipoR1在EH心室重構的形成過程中起著至關重要的作用，心肌AdipoR1表達下降是導致心室重構的重要因素。

綜上所述，SHR存在顯著的心室重構，血清APN及心肌AdipoR1表達下降、IR程度增加；SHR心室重構可能與血清APN及心肌AdipoR1表達下降有關。但本研究未對SHR大鼠心室重構和血清APN、心肌AdipoR1進行分階段動態觀察研究，且未對受體后信號通路進行深入研究，具體機制有待進一步實驗證實。

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