血漿硫氧還蛋白對肝癌的診斷價值研究

劉保魁，楊玉秀，韓雙印，張立達，白陽秋，房新輝

肝癌是我國常見的腫瘤之一，起病隱匿，惡性程度高，大部分患者發現時已處于中晚期，因此肝癌的早期診斷至關重要。甲胎蛋白(AFP)是目前臨床上應用最廣泛的診斷肝癌的腫瘤標志物，但是，仍然有30%～40%的肝癌患者AFP水平在參考范圍內[1]。所以，尋求一種新的腫瘤標志物或聯合各種腫瘤標志物診斷肝癌成為一種重要策略。硫氧還蛋白(TRX)是一類分布廣泛的小分子量多功能蛋白，其含有兩個高度保守的半胱氨酸殘基活性位點，該活性中心可催化許多氧化還原反應[2]。在生理條件下，TRX參與細胞的生長和增殖、維持細胞內環境穩態、抗氧化應激、調控細胞凋亡等[3]。另外，許多研究表明TRX參與不同腫瘤及其他病變的發生和發展[4]。然而，有關血漿TRX用于診斷肝癌的研究并不多見。本研究應用ELISA法檢測TRX在肝癌患者血漿中的表達并評估其診斷肝癌的價值。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇2012年5—9月河南省人民醫院肝膽外科住院的肝癌患者90例(肝癌組)，其中男50例，女40例；年齡32～75歲，平均(50.2±10.5)歲。均經病理檢查證實為肝癌，術前均未進行放療及化療。臨床分期根據國際抗癌聯盟的TNM系統分期法劃分。選擇同期河南省人民醫院消化內科肝硬化患者40例(肝硬化組)，其中男25例，女15例；年齡35～70歲，平均(45.0±9.5)歲。選擇同期35例同年齡段健康體檢者(對照組)，其中男25例，女10例；平均(42.0±7.3)歲。

1.2標本采集抽取清晨空腹靜脈血3 ml，置于EDTA抗凝的無菌試管中，室溫3 500 r/min離心15 min，收集血漿置于-80 ℃保存待測定。

1.3ELISA檢測ELISA試劑盒購自美國RD公司，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。主要檢測儀器為BIO-RAD680型酶聯免疫檢測儀，于450 nm處測吸光度(OD)，讀取OD值，然后根據標準品應用Excel 2007(微軟公司)軟件繪制標準曲線，通過已知標準品水平值計算樣品水平值。每1個血漿樣品測2次求平均值。

1.4統計學方法采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析。因AFP和TRX水平均不符合正態分布，采用中位數(四分位數間距)〔M(QR)〕表示。組間比較采用Mann-Whitney 或Kruskal-Wallis檢驗，相關分析采用非參數Spearman檢驗。采用受試者工作特征(ROC)曲線分析AFP和TRX診斷肝癌的敏感度和特異度。以P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1AFP和TRX水平比較肝癌組患者血漿中AFP和TRX水平均高于肝硬化組和對照組，肝硬化組AFP水平高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)；肝硬化組TRX水平與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表1)。

表1　3組受檢者血漿AFP和TRX水平比較〔M(QR)，μg/L〕

注：與肝癌組比較，*P<0.05；與對照組比較，△P>0.05；與對照組比較，▲P<0.05

2.2肝癌患者AFP和TRX水平的相關性分析將肝癌患者血漿TRX水平與AFP水平進行Spearman相關分析，結果顯示TRX水平與AFP水平無直線相關性(r=-0.06,P=0.560)。

2.3肝癌患者血漿TRX與臨床特征關系不同年齡、性別、肝炎病毒感染狀態、腫瘤大小、腫瘤組織分化程度及TNM分期的肝癌患者血漿中TRX的水平間差異均無統計學意義(P>0.05，見表2)。

2.4TRX和AFP對于診斷肝癌價值的比較ROC曲線分析顯示，TRX的ROC曲線下面積為0.840,95%可信區間為(0.775，0.892)。最佳臨界值為33.0 μg/L，其敏感度為74.4%，特異度為77.3%。不同臨界值TRX的敏感度和特異度見表3。AFP的ROC曲線下面積為0.796，95%可信區間為(0.727，0.855)。最佳臨界值為61.0 μg/L,敏感度為56.67%，特異度為80.33%(見圖1)。

2.5TRX和AFP聯合診斷肝癌的價值90例肝癌患者血漿TRX陽性50例，陽性率55.6%，AFP陽性例數30例，陽性率33.3%；TRX聯合AFP檢測陽性例數65例，陽性率72.3%。

表2肝癌患者血漿TRX水平與臨床特征之間的關系(μg/L)

Table2Relationship between plasma TRX levels with clinical parameters of HCC patients

例數中位數四分位數間距Z(H)值P值年齡(歲)-0 88?0 376　≤503854 6771 42　>505244 0962 78性別-1 57?0 116　男性5055 5061 35　女性4043 0577 28肝炎病毒感染狀態-0 90?0 371　乙型肝炎病毒5154 6759 30　丙型肝炎病毒3944 0946 04腫瘤大小(cm)-0 20?0 837　≤54852 2058 78　>54246 0570 24組織分化程度0 0870 958　高分化3145 0158 22　中分化3446 0565 39　低分化2555 0147 23TNM分期0 3430 754　Ⅰ+Ⅱ3447 5460 54?、?244 9558 89?、?460 4070 01

注：*為Z值

表3不同臨界值TRX對肝癌的診斷價值(%)

Table3Diagnostic values of plasma TRX at different cut-off values determined by ROC curve

臨界值(μg/L)敏感度特異度陽性預測值陰性預測值　16 0　91 1148 0067 881 8　33 0　74 4477 3379 871 6120 030 0098 6796 454 0

圖1　AFP和TRX診斷肝癌的ROC曲線

Figure1ROC curve of AFP and TRX for diagnosis of hepatocellular carcinoma

3　討論

肝癌是常見的消化系統腫瘤之一，其發生、發展是一個多因素、多階段及多基因相互作用的過程[5]。其起病隱匿，惡性程度高，大部分患者發現時已處于中晚期，而且其發病率有逐年上升的趨勢。因此肝癌的早期診斷仍是肝癌診治研究的熱點之一。AFP是目前臨床上診斷肝癌應用最廣泛的腫瘤標志物，但是，其敏感度和特異度不高。尋求新的腫瘤標志物勢在必行。

TRX是一種相對分子量為12 kDa的緊密球形蛋白，于1964年首次在大腸埃希菌中被發現，是核糖核酸還原酶的供氫體[6]。TRX氨基序列中含有1個氧化還原活性的Cys-Gly-Pro-Cys氨基酸序列，該活性中心可催化許多氧化還原反應[7]。在生理條件下，TRX參與細胞的生長和增殖、維持細胞內環境穩態、抗氧化應激、調控細胞凋亡等。最近許多研究表明TRX在各種腫瘤患者組織中高表達，如乳腺癌[8]、宮頸癌[9]、胃癌[10]和肝癌[11]等。而許多研究也證明血清TRX可以作為急性胰腺炎[12]、哮喘[13]、腹膜惡性間皮瘤[14]等多種疾病的標志物。盡管已有研究發現血清TRX水平在肝癌患者中增高[15]，但其臨床診斷價值并沒有深入研究。本研究應用ELISA法檢測TRX在肝癌患者血漿中的水平并評估了其診斷肝癌的價值，研究發現，肝癌患者血漿TRX水平明顯高于肝硬化組和對照組。這說明TRX在肝癌的發生發展中起著重要作用，并提示血漿TRX可能成為肝癌的腫瘤標志物，這和Yamada等[13]的發現結果一致。研究認為細胞在氧化應激時會向血液中釋放TRX[16]；另外也有研究表明在一些癌組織中血清TRX水平增高，但切除癌組織后血清中的TRX水平又會下降[15],這說明腫瘤患者血清中的TRX是由腫瘤組織分泌的。本研究中肝癌患者血漿TRX水平增高可能來源于乙型肝炎或丙型肝炎病毒感染造成的氧化應激和腫瘤組織自身釋放所致。

ROC曲線分析表明TRX診斷肝癌的最佳臨界值為33.0 μg/L，其敏感度為74.4%，特異度為77.3%。肝癌患者血漿TRX水平與AFP水平無明顯直線相關性，這表明AFP陰性肝癌患者可能TRX陽性，兩者聯合檢測可以提高肝癌的診斷率。另外，本研究還發現，肝癌患者血漿TRX水平與性別、年齡、腫瘤大小、肝炎病毒感染情況、腫瘤組織分化程度及TNM分期等無關，具體機制還有待進一步研究。

綜上所述，本研究表明血漿TRX蛋白可成為診斷肝癌的新的輔助腫瘤標志物，TRX蛋白和AFP聯合檢測能提高肝癌的早期診斷率，然而同時也需要大規模的臨床試驗證明此結論。

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